Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-07-14T19:15:45Z
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Previous issue date: 2006 / O Trypanosoma cruzi é o parasita causador da doença de Chagas, a qual atinge 16-18 milhões de pessoas. Recentemente, o seqüenciamento do genoma do T. cruzi foi concluído, o que deu novo impulso aos projetos pós-genômicos visando a elucidação da expressão diferencial de proteínas ao longo do ciclo de vida do parasita. A proteômica é bastante apropriada para este fim, já que a regulação da expressão de proteínas em T. cruzi ocorre em nível
póstranscricional. Objetivando-se o estudo das proteínas básicas do proteoma
de T. cruzi, condições para eletroforese bidimensional (2-DE) em pH alcalino das
formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas foram estabelecidas.
Tornou-se necessário otimizar as condições experimentais para tais géis, já que
nessa faixa de pH é normal o aparecimento de longas listras horizontais
(streaking), baixa resolução de spots e baixa reprodutibilidade. O protocolo final,
desenvolvido para formas epimastigotas, consistiu na adição de 10% de
isopropanol ao tampão de reidratação do gel de gradiente imobilizado de pH,
aplicação da amostra em uma fita de papel de filtro conectada ao anôdo, uso de
fita embebida com solução de DTT junto ao catôdo e focalização isoelétrica
utilizando-se o equipamento Multiphor II (GE Healthcare). Um total de 10 spots
do gel de epimastigotas foram identificados por impressão digital do mapa
peptídico (peptide mass fingerprint). As proteínas identificadas foram:
fosfoglicerato quinase, prostaglandina F2a sintase, peptídeo metionina sulfóxido
redutase, metiltioadenosina fosforilase, proteína dissulfeto isomerase, AKB
ligase e quatro proteínas hipotéticas (hipotéticas). As condições padronizadas
para a 2-DE foram aplicadas na construção de mapas bidimensionais das formas tripomastigotas e amastigotas. Os mapas resultantes permitiram verificar
diferenças de expressão entre os proteomas. Por último, foi testada a metodologia do gel “dois em um” para 2-DE em faixa ampla de pH, que mostrou resultados promissores para futuras análises da expressão comparativa de
proteínas em T.cruzi. / Trypanosoma cruzi is the parasite that causes Chagas disease, a chronic
illness that affects 16-18 million people. Recently, the sequencing of T. cruzi
genome was concluded. This accomplishment stimulated post-genomic projects
aiming at elucidating the differential protein expression through the parasite life
cycle. Proteomics is the most suitable methodology for this since T. cruzi protein
expression regulation occurs at post-transcriptional level. In order to study the
basic proteins from T. cruzi proteome, conditions for two-dimensional gel
electrophoresis (2-DE) of epimastigote, trypomastigote and amastigote life forms
were developed. It was necessary to optimize the 2-DE experimental conditions
since in the alkaline pH range the gels usually presents spot streaking, low
resolution and poor reproducibility. The final protocol, developed for
epimastigotas, consisted of the addition of 10% isopropanol to the IPG gel strip
rehydration buffer, sample loading using the “paper bridge” method, use of paper
strip embedded in DTT solution near the cathode and isoelectric focusing using
the Multiphor II apparatus (GE Healthcare). A total of 10 spots from the
epimastigote gel were identified by peptide mass fingerprinting. The identified
proteins were phosphoglycerate kinase, prostaglandin F2a synthase, methionine
peptide sulfoxide reductase, methylthioadenosin phosphorylase, protein disulfide
isomerase, AKB ligase and four hypothetical proteins. The optimized 2-DE
conditions were applied to the construction of trypomastigotes and amastigotas
two dimensional maps. The resulting maps permitted the visualization of
differences in protein expression among the proteomes. Finally, the “two-in-one”
2-DE methodology for wide range pHs was tested and gave promising results
that may be used in future studies on T. cruzi comparative protein expression.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/5253 |
| Date | January 2006 |
| Creators | Magalhães, Adriana Dias |
| Contributors | Ricart, Carlos André Ornelas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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