The important connection between dynamics, structure and function of enzymes still remains unclear and is, hence, an interesting relationship to investigate. In this thesis, the enzymes NADH oxidase (NOX) from Thermus thermophilus and mycobacterium tuberculosis (Mtb) protein tyrosine phosphatase B (PtpB) were chosen as systems to study the influence of solution conditions on protein structure and flexibility in relation to their catalytic activity. Nuclear magnetic resonance (NMR) and isothermal titration calorimetry (ITC) techniques were used in the study of NOX. NMR and differential scanning fluorimetry (DSF) were utilized to assess the sample stability of PtpB under various buffer conditions.NOX is a 54 kDa homodimeric enzyme with many potential biotechnology applications. It accepts cofactors flavin mononucleotide (FMN) or flavin adenine dinucleotide (FAD). It has high thermal stability and its activity increases with the addition of low concentrations of urea. Using enzymes in vitro provides us a lot of freedom to control its environment, which is useful to look at changes occurring under different conditions. Thus, NMR allowed us to investigate these interesting characteristics on NOX dynamics and structure. When Mtb infects host cells it secrets among others, PtpB, to disrupt signalling pathways and blunts immune responses. PtpB contains a two-helix lid that completely buries the active site and it is proposed that it has evolved as a novel mean of protection against host chemical defences and affords substrate access. An investigation of conformational dynamics of the lid domain of PtpB using NMR would elucidate a relation between conformation and function of Ptpb, which to date, is still unknown and would contribute to the development of inhibitors as potential drugs. In order to do this, it is essential to obtain a stable sample that will give optimal quality NMR spectra. NMR and DSF were used to optimize PtpB NMR sample conditions and spectral quality. We employed a suite of novel 15N NMR relaxation experiments to estimate the extent of broadening due to microsecond-timescale motions and to measure exchange-free transverse relaxation rates on a per-residue basis of NOX. These measurements allowed us to identify several residues involved in dynamical processes. Moreover, order parameters, S2, determined from standard 15N T1, T2 and {1H}-15N steady NOE experiments, allowed the identification of additional residues characterized by motions on nanosecond-picosecond time scales. We then investigated the effects of temperature, urea addition, cofactor and NAD+ product binding to NOX using NMR and ITC. For each condition studied, chemical shift displacement of NMR peaks is significant relative to all other peaks only for a reoccurring small subset of residues. This cluster of residues is located around the active site of the enzyme and thus, suggests evidence of a relationship between concerted conformational rearrangement of NOX structure and NOX catalytic activity. An increase in NMR spectral quality and a NMR sample of PtpB with increased thermal stability, higher yields and reduced aggregation was obtained for further NMR dynamic experiments. This was achieved by optimizing the sample conditions by performing several NMR titrations and DSF experiments. Assessing the thermal stability of enzymes with different additives using DSF could be easily introduced during the elaboration of protein purification protocols as a routine method to optimize NMR sample conditions for NMR studies. / Le lien important entre la dynamique, la structure et la fonction des enzymes n'est pas encore bien défini et est donc une relation intéressante à étudier. Dans cette thèse, les enzymes NADH oxydase (NOX) de Thermus thermophilus et mycobacterium tuberculosis protéine tyrosine phosphatase B (PtpB) sont les systèmes choisis pour étudier l'influence des conditions de solution sur la structure et la flexibilité des protéines par rapport à leur activité catalytique. Les techniques de résonance magnétique nucléaire (RMN) et de calorimétrie de titration isothermique (ITC) ont été utilisées dans l'étude de NOX. La RMN et la fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) ont été utilisées pour évaluer la stabilité de l'échantillon de PtpB dans diverses conditions de tampons. NOX est une enzyme homodimérique avec de nombreuses applications biotechnologiques potentielles. NOX accepte les cofacteurs flavine mononucléotide (FMN) ou flavine adénine dinucléotide (FAD). L'enzyme a une stabilité thermique élevée et son activité augmente avec l'addition de faibles concentrations d'urée. Utiliser des enzymes in vitro donne beaucoup de liberté pour contrôler leur environnement, utile pour examiner les changements qui se produisent dans différentes conditions. Ainsi, RMN nous a permis d'étudier ces caractéristiques intéressantes sur la dynamique et la structure de NOX. Lorsque Mtb infecte les cellules, il secrète PtpB qui perturbe les voies de signalisation et affaibli les réponses immunitaires. PtpB contient un couvercle de deux hélices qui enterre complètement le site actif et il est proposé qu'il ait évolué ainsi en protection contre les défenses chimiques et permet un accès au substrat. Une étude de la dynamique du domaine du couvercle de PtpB utilisant la RMN éluciderait la relation entre la conformation et la fonction de PTPB et contribuerait au développement d'inhibiteurs en tant que médicaments potentiels. Pour ceci, il est essentiel d'obtenir un échantillon stable qui donnera des spectres RMN de qualité optimale. RMN et DSF ont été utilisés pour optimiser les conditions d'échantillonnage de PtpB pour la RMN et la qualité spectrale. Nous avons utilisé une suite de nouvelles expériences de relaxation de 15N par RMN pour estimer l'ampleur de l'élargissement des signaux en raison de mouvements à l'échelle de temps des microsecondes et de mesurer les taux de relaxation transversale sans échange pour chaque résidu de NOX. Ces mesures nous ont permis d'identifier plusieurs résidus impliqués dans les processus dynamiques. De plus, les paramètres d'ordre, S2, déterminées à partir des expériences standards de T1, T2 et NOE, ont permis d'identifier des résidus additionnels caractérisés par des mouvements sur des échelles de temps de nanosecondes à picosecondes. Nous avons ensuite étudié les effets de la température, urée, la liaison de cofacteur et du produit à NOX en utilisant la RMN et le ITC. Pour chaque condition étudiée, la variation de déplacement chimique des signaux RMN n'est significative par rapport à tous les autres signaux que pour un petit sous-ensemble récurrent de résidus. Cet amas de résidus est situé autour du site actif de l'enzyme et ainsi, suggère preuve d'une relation entre un réarrangement conformationnel concertée de la structure de NOX et de son activité catalytique. Une augmentation de la qualité spectrale de RMN et un échantillon de PtpB pour la RMN avec une meilleure stabilité thermique, des rendements plus élevés et une agrégation réduite ont été obtenus pour de futures expériences dynamiques par RMN. Ceci a été réalisé en optimisant les conditions de l'échantillon en effectuant plusieurs titrages par RMN et des expériences de DSF. L'évaluation de la stabilité thermique des enzymes avec différents additifs à l'aide de DSF pourrait facilement être introduit lors de l'élaboration de protocoles de purification de protéines comme une méthode routinière pour optimiser les conditions d'échantillons pour les études par RMN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119414 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Miletti, Teresa |
| Contributors | Anthony Mittermaier (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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