Cytochrome P450 enzymes (CYPs or P450s) form a ubiquitous family of heme-dependent monooxygenases known mainly for their role in xenobiotic metabolism and their remarkable ability to regio- and stereoselectively oxidize inactivated C-H bonds, a feat that is difficult to achieve by chemical methods. Unfortunately, our ability to study and exploit these enzymes as in vitro biocatalysts has been limited by their low activity, low stability and poor product predictability. This thesis focuses on the study of human drug metabolizing P450 isoforms, namely CYP2E1, CYP3A4 and CYP2D6 because of their exceptional ability to accept a large variety of substrates. In Chapter 2, we demonstrate the utility of "type II ligands" as chemical auxiliaries for biocatalysis with human CYP2E1. We show that linking the chemical auxiliary nicotinate to a variety of short hydrocarbon substrates can promote their oxidation with predictable regioselectivity at the secondary aliphatic or alkenyl C-H bond furthest from the auxiliary. The origin of this selectivity was rationalized through docking studies of our auxiliary-substrate compounds with reported X-ray crystals structures of CYP2E1. These results not only confirm the general utility of the chemical auxiliary approach pioneered by our lab to direct the predictable oxidation of inactivated C-H bonds by P450 enzymes, but also provide a system with complementary regioselectivity.A short study of the effects of macromolecular crowding on the activity of human CYP3A4 and CYP2D6 is presented in Chapter 3. We found that certain crowding agents were not detrimental to enzyme activity while others had a negative effect. Moreover, certain conditions (initially tested as controls) that improved enzymatic activity were uncovered. In Chapter 4, the non-covalent oriented-immobilization of CYP3A4 via its C-terminal histidine-tag is described. We show that immobilization on Ni-NTA agarose resin via this strategy has no detrimental effect on enzyme activity or stability. The lyoprotectant properties of Ni-NTA were also investigated. In Chapter 5, we designed and characterized a mutant of CYP3A4 that retains its enzymatic activity upon modification with a variety of fluorescent maleimide dyes via a single cysteine residue on its surface, namely C64. We also show that the activity of this mutant is preserved upon immobilization onto solid supports via this same cysteine residue. Finally, results of a preliminary feasibility study towards applying this immobilization strategy to eventual single-molecule fluorescence microscopy studies are presented. / Les enzymes cytochrome P450 (CYPs ou P450) forment une famille omniprésente de mono-oxygénases possédant un noyau hème au site-actif. Ces enzymes sont surtout connues pour leur rôle dans le métabolisme de produits pharmaceutiques et pour leur capacité remarquable à oxyder les liens C-H non-activés de façon régio- et stéréosélective. Malheureusement, notre capacité d'étudier et d'utiliser ces enzymes comme biocatalyseurs in vitro est limitée par leur faible activité, instabilité et une incapacité des connaissances actuelles à prédire leurs produits.Dans le chapitre 2, nous démontrons l'utilité des ligands de type II comme auxiliaires chimiques pour la biocatalyse avec CYP2E1 humaine. Nous démontrons que l'auxiliaire chimique nicotinate, lorsque lié à une variété d'hydrocarbures courts, peux promouvoir leur oxydation avec une régiosélectivité prévisible pour le lien C-H secondaire aliphatique ou alcényle le plus éloigné de l'auxiliaire. L'origine de cette sélectivité a été rationalisée à l'aide de «docking» moléculaire de nos composés auxiliaire-substrats à l'intérieure de structures cristallines de CYP2E1 publiées par d'autres chercheurs. L'utilité d'auxiliaires chimiques pour contrôler la régiosélectivité des enzymes P450 avait déjà été démontrée par notre groupe de recherche. Les résultats présentés dans ce chapitre offrent non seulement une confirmation du potentiel de cette stratégie, mais aussi un système complémentaire pour l'oxydation prévisible de liens C-H non-activés par les enzymes P450. Ces résultats confirment également la généralité de l'approche mis au point dans notre laboratoire qui décrit l'utilisation d'une auxiliaire chimique pour diriger l'oxydation prévisible de liens C-H non-activés par les enzymes P450.Une étude des effets de l'encombrement macromoléculaire sur l'activité enzymatique des CYP3A4 et CYP2D6 humaines est présentée dans le chapitre 3. Nous avons trouvé que leur activité demeure inchangée par la présence de certains agents encombrants alors que d'autres ont un effet négatif. De plus, certaines conditions (testées initialement comme contrôle) qui améliorent l'activité enzymatique ont été découvertes.Dans le chapitre 4, l'immobilisation orienté non-covalente de CYP3A4 par son étiquette de type his-tag C-terminale est décrite. Nous démontrons que son immobilisation sur une résine Ni-NTA à base d'agarose via cette stratégie n'a aucun effet négatif sur l'activité ou la stabilité de l'enzyme. Les propriétés lyoprotectrices de cette résine ont aussi été investiguées.Dans le chapitre 5, nous concevons et caractérisons un mutant actif de CYP3A4 lors de modifications avec une variété de maléimides fluorescentes à l'endroit d'un unique résidu cystéinique à sa surface, soit le C64. Nous démontrons aussi que ce mutant préserve son activité lorsqu'immobilisé sur des supports solides par ce même résidu cystéinique. Finalement, les résultats d'études préliminaires sont présentés qui envisagent l'application de cette stratégie d'immobilisation envers des études éventuelles de spectroscopie de fluorescence à la résolution d'une seule molécule.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114213 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Ménard, Amélie |
| Contributors | Karine Auclair (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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