An often proposed mechanism to overcome the system of efflux transporters and tight junctions present at the blood brain barrier (BBB) is the receptor-mediated transport via endocytosis. Among the proposed transport vehicles, the transferrin receptor (TfR) has been considered to be one of the most attractive targets. Besides transferrin itself and the antibody OX26 (anti-rat TfR-antibody), it has recently been shown that peptides are also able to bind to the transferrin receptor and are internalized into TfR expressing cells. In this study we evaluated the ability of the 68Ga-labeled peptide THRPPMWSPVWP to become internalized into human TfR bearing cells to pre-evaluate its potential to act as a carrier system for small molecules across the BBB utilizing the TfR receptor located on the endothelial cells. To prove the validity of this concept we first synthesized the peptide THRPPMWSPVWP, and then a conjugate consisting of the D2 receptor ligand fallypride and the peptide which was synthesized by our collaborators and evaluated as to its binding affinity towards the D2 receptor. The conjugate still showed a high receptor affinity (Ki = 27 nM) despite the strong structural alteration exerted by the peptide. / For radioactive-labeling, the reported TfR-binding peptide THRPPMWSPVWP was derivatized with p-SCN-Bn-NOTA. It was then labelled with 68Ga by our collaborators. The uptake of the 68Ga-labelled peptide into TfR-bearing cells was investigated using two human TfR-expressing cell lines, the human glioblastoma cell line U87MG and the human colon adenocarcinoma cell line HT-29 to assess the peptides' potential as a carrier molecule targeting the TfR receptor . The binding was found to be less than 1% after 60 min incubation at 37°C. / These results suggest that the concept of using peptide THRPPMWSPVWP to act as a carrier system for short lived PET radio-pharmaceuticals across the BBB within a reasonable time span is doubtful. However, further experiments have to be carried out to determine the potential of this peptide as transferrin receptor targeting carrier molecule for therapeutic agents. / Besides, and owing to the need for optimization of the synthetic procedures for 18F labeling of biologically-active peptides for clinical PET, we also investigated the possibility to synthesize a glucose based labeling synthon 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-[18F]fluoro-β-D-glucopyranoside, to radiolabel alkyne derivatized peptides with 18F using click chemistry. Our strategy would combine the advantages of carbohydration of peptides with the fast and efficient click reaction. We synthesized 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-O-p-toluene sulfonyl-β-D- glucopyranoside in an overall chemical yield of 80%, which served as a labeling precursor bearing an azide group ready for coupling to an alkyne derivative of a biologically active peptide by click chemistry and a p-toluene sulfonyl group ready for radio-labeling with 18F by a nucleophilic substitution reaction. The second compound was 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-fluoro-β-D-glucopyranoside in an overall chemical yield of 77%, which served as a reference compound to establish HPLC and TLC conditions for the radio-labeling experiments. Initial labeling experiments with nucleophilic 18F did not yield the desired 18F-labeled glucose derivative so far. We are currently taking efforts to radiolabel the precursor with 18F buy re-crystallizing the precursor several times as it was proven by HPLC that it still contains some impurities. These impurities can compromise the intended labeling reaction with 18F. / Un mécanisme proposé expliquant le transport par efflux présent dans la 'blood brain barrier' consiste en un système de transport membranaire assisté faisant intervenir des récepteurs spécifiques, par d'endocytose. Parmi les vésicules de transport proposées, les récepteurs de transferrine (TfR) sont considérés comme les plus attractives. A part la transferrine et l'anticorps pour clone MRC OX-26 (anticorps TfR anti-rat), il a été montré que des peptides sont aussi capables de se lier spécifiquement au récepteur de la transferrine, puis d'y être internalisé dans les cellules possédant les récepteurs à transferrine. Dans cette étude, nous avons évalué la possibilité du peptide 'THRPPMWSPVWP' marqué avec du 68G de s'internaliser dans des cellules humaines présentant les récepteurs TfR. Nous avons aussi évalué son potentiel de se comporter comme vecteur de transport de petites molécules à travers la 'blood brain barrier'. Nous avons utilisé des cellules endothéliales avec des récepteurs TfR. Pour prouver la validité du concept, nous avons synthétisé le peptide THRPPMWSPVWP, puis conjugué au fallypride de type D2, qui est un ligand avec une grande affinité pour les récepteurs du TfR. L'ensemble a été évalué par nos collaborateurs afin de vérifier l'affinité de liaison vis-à-vis des récepteurs du TfR. Ce conjugué à montré une grande affinité précités (Ki = 27 nM), malgré de fortes altérations au niveau de sa structure causées par la présence du peptide. Pour le marquage radioactif, le peptide THRPPMWSPVWP bioconjugué ci-dessus a été dérivé avec le p-SCN-Bn-NOTA et radio-marqué au 68Ga par nos collaborateurs. Les propriétés de ce peptide ont été étudiées en utilisant deux lignées cellulaires différentes présentant les récepteurs TfR, soit des cellules de type tumoral glial (U-87 MG) et des cellules carcinomes de côlon humain (HT-29), afin d'étudier le potentiel du peptide à se comporter comm / D'autre part, du fait de l'optimisation des procédures de synthèse pour le radio marquage au 18F de peptides biologiques actifs, dans le cadre d'études cliniques de 'PET', nous avons envisagé de synthétiser un nouveau synthon radio-marqué dérivant du glucose, le 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-[18F]fluoro-β-D-glucopyranoside, pour radio-marquer des dérivés de type 'alkyne', par la technique de 'click chemistry'. Notre stratégie combine les avantages du processus de 'carbohydratation' des peptides et de la réaction de 'click chemistry'. Nous avons synthétisé le 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-O- p-toluene sulfonyl β-D-glucopyranoside avec un rendement de 80%. Ce dernier possède un groupe p-toluène sulfonyle qui sert de précurseur pour radio-marquer la molécule au 18F par une réaction de substitution nucléophile, et présente également un groupement 'azide', permettant le couplage rapide avec un peptide actif possédant une fonction 'alkyne'. Le 2eme composé préparé est le 2,3,4-tri-O-acetyl-1-azido-6-fluoro-β-D-glucopyranoside, avec un rendement de 77%. Ce dernier servant de référence pour établir les conditions HPLC et par CCM nécessaires au radio-marquage. Les études préliminaires avec le 18F comme nucléophile n'ont pas conduit au composé de type 'glucose' radio-marqué au 18F. Nos efforts actuels se portent sur le radio-marquage du précurseur au 18F en recristallisant ce dernier. Il a été montré par HPLC que ce dernier contient des impuretés, qui empêcheraient le radio-marquage au 18F.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.87014 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Nada, Dina |
| Contributors | Ralf Schirrmacher (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Neurology and Neurosurgery) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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