This thesis describes our advances in the preparation of lipophilic fluorogenic probes for the specific imaging of reactive oxygen species (ROS) in the lipid membrane of live cells. The work revolves around a simple design involving the preparation of a two segment receptor-reporter type free radical scavenger-fluorophore probe (an off-on fluorogenic antioxidant indicator). The receptor segment in the probe mimics the structure and activity of the naturally occurring antioxidant α-tocopherol. A covalently tethered lipophilic fluorophore serves the purpose of reporting, via emission enhancement, structural changes at the receptor end following its reaction with free radicals.In this thesis we initially explore the off/on molecular switch mechanism operating in the first generation fluorogenic probe we prepared, a Bodipy-Trolox adduct that we named B-TOH. Through mechanistic studies including oxygen uptake, laser flash photolysis, electrochemistry, and DFT calculations we were able to establish that photoinduced electron transfer (PeT) occurs from the receptor to the reporter segment. Molecular imaging of lipid peroxyl radicals in model lipid membranes and in live cells are next reported and we lay out the potential and drawbacks for utilizing B-TOH towards monitoring lipid peroxyl radicals in the lipid membrane of live cells. The information gained in these two chapters allowed us to determine the reporter (fluorophore) electrochemical and spectroscopic requirements that need to be met in order to modulate the sensitivity of B-TOH. We subsequently describe the preparation, spectroscopic, and electrochemical characterization of a family of 16 new Bodipy dyes with tuneable redox potentials and versatile functional groups. Electron withdrawing or donating groups (Et, H, Cl or CN) at positions C2 and C6 enabled tuning the redox potentials within a ca. 0.7 eV window without significantly affecting either the HOMO-LUMO gap or the absorption and emission spectra. Hydroxymethyl or formyl groups at the meso (C8) position in turn provided functionality for covalent tethering to receptors and biomolecules of interest. The dyes can thus be coupled to both electrophiles and nucleophiles. We subsequently generate two new fluorogenic probes (second generation) where we exploit the new Bodipy chromophores synthesized. We further optimize the linker moiety between receptor and reporter segment in order to control the chemical reactivity of the probes. The development of a high-throughput fluorescence assay for monitoring kinetics of peroxyl radical reactions in liposomes is described where the evolution of the fluorescence intensity over time provides a rapid facile method to conduct competitive kinetic studies in the presence of α-tocopherol and analogues We additionally explore the selective targeting of cell organelles, specifically mitochondria (third generation probes). A chapter is devoted to describe the synthesis and mechanistic studies of mitochondria-targeting probes.We conclude this thesis with a chapter dedicated to Conclusions and New directions. The new probes here described will allow a non-invasive spatial and temporal monitoring of the oxidative state in live cell on an organelle level. We may foresee that imaging studies with specific sensors will ultimately enable us to better understand vital links between the chemistry and the biology of ROS. / Cette thèse discute de la préparation et du développement de sondes fluorescentes pour l'imagerie spécifique des espèces réactives de l'oxygène (ERO) dans les membranes de cellules vivantes. Le travail est centré sur une conception simple impliquant la préparation d'une sonde piégeuse de radicaux libres en deux segments récepteur-reporteur (un indicateur antioxydant fluorescent arrêt-marche). Le segment récepteur de la sonde mimique la structure et l'activité de l'antioxydant naturel α-tocophérol. Un fluorophore lipophile lié par un lien covalent rapporte, à l'aide d'une augmentation de la fluorescence, les changements structurels du côtè récepteur suite à sa réaction avec des radicaux libres.Cette thèse explore initialement le mécanisme de fonctionnement de l'interrupteur arrêt / marche moléculaire dans la sonde de première génération que nous avons préparée, un produit d'addition Bodipy-Trolox que nous avons nommé B-TOH. Par l'entremise d'études mécanistiques incluant l'absorption d'oxygène, la photolyse éclair au laser, électrochimie et calculs sur la théorie de la fonctionnelle de la densité, nous étions capable de déterminer que le transfert d'électron photoinduit se produit du segment récepteur au segment reporteur. L'imagerie moléculaire de radicaux peroxydes lipidiques dans les membranes lipides modèles et dans les cellules vivantes sont ensuite rapportées et nous mentionnons les inconvénients potentiels reliés à l'utilisation de B-TOH à l'évaluation de radicaux peroxydes lipidiques dans la membrane lipide de cellules vivantes. L'information acquise durant ces deux chapitres nous a permis de déterminer les exigences électrochimiques et spectroscopiques du reporteur (fluorophore) qui doivent être remplies afin de moduler la sensibilité de B-TOH. Par la suite, nous décrivons la préparation ainsi que la caractérisation spectroscopique et électrochimique de 16 nouvelles molécules Bodipy avec des potentiels d'oxydoréduction variables et groupes fonctionnels polyvalents. Des groupes donneur ou accepteur d'électrons (Et, H, Cl ou CN) aux positions C2 et C6 permettent de changer le potentiel d'oxydoréduction dans une fenêtre de ca. 0.7 eV sans changer significativement ni l'écart HOMO-LUMO ni les spectres d'absorption ou d'émission. Des groupes hydroxymethyl ou formyl à la position méso (C8) quant à eux fournissent la fonctionnalité requise pour la formation de liens covalents avec des récepteurs et molécules biologiques d'intérêts. Ces molécules fluorescentes peuvent donc être couplées non seulement aux électrophiles mais, également aux nucléophiles. Nous générons ensuite deux nouvelles sondes fluorescentes (deuxième génération) en exploitant les nouveaux chromophores Bodipy synthétisés. Nous optimisons davantage le groupe caractéristique lieur entre les segments récepteurs et reporteur afin de contrôler la réactivité chimique des sondes. Le développement d'une analyse à haut débit qui suit la cinétique de la réaction des radicaux peroxydes dans des liposomes est décrite où l'évolution de l'intensité de la fluorescence avec le temps nous fournie une méthode rapide et facile pour mener des études cinétiques compétitives dans la présence de α-tocophérol et ses analogues.Nous explorons additionnellement le ciblage sélectif d'organelle cellulaire, spécifiquement des mitochondries (sonde de troisième génération). Un chapitre est dévoué à la description de la synthèse et aux études mécanistiques de sondes cibleuses de mitochondrie. Nous concluons cette thèse par un chapitre dédié aux conclusions et aux nouvelles directions. Les nouvelles sondes décrites ici permettront l'évaluation spatiotemporelle et non-invasive de l'état d'oxydation de cellules vivantes au niveau des organelles. Nous pouvons prévoir que des études d'imageries avec des sondes spécifiques vont éventuellement nous permettre de mieux comprendre des liens vitaux entre la chimie et la biologie des ERO.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.114375 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Krumova, Katerina |
| Contributors | Gonzalo Cosa (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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