The reverse transcriptase (RT) of the human immunodeficiency virus (HIV) has both polymerase and ribonuclease H (RNase H) activity, and is a key enzyme in the HIV life cycle as it converts the viral RNA genome into double-stranded DNA. A series of studies built around the theme of chemically modified nucleic acids are described in order to: (1) better understand the biochemical processes of reverse transcription in HIV-1, (2) synthesize antiretroviral agents directed to novel targets on HIV-1 (RT), and (3) develop screening methods incorporating fluorescent nucleobase analogues to uncover new drug candidates. We demonstrated how chemically modified nucleic acid hairpins inhibited the RNase H activity of HIV-1 RT. For example, substituting natural RNA for 2'-deoxy-2'-fluoro-ribonucleotides, 2'-deoxy-2'-fluoro-arabinonucleotides, locked nucleic acids or conjugation of cholesterol at the 5'-terminus modulated the potency of hairpins for RNase H activity. Biochemical methods indicated that the substrate for HIV-1 RT, a short primer-long template, may be bound at the polymerase domain with its trajectory diverted away from the RNase H domain by the presence of the synthetic hairpins. Furthermore, the binding of hairpins to HIV-1 RT had no adverse affects on the potency of chain terminators such as 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT), a widely used antiviral agent. This discovery supports a model where the RNase H activity can be an antiretroviral target independent of the rest of RT. We synthesized 6-phenylpyrroloribocytidine (PhpC), a novel fluorescent cytidine analogue incorporated into RNA. The PhpC-containing RNA formed native-like duplex structures with complementary strands and fluorometrically reported upon binding to complementary RNA and DNA strands. PhpC was shown to rank among the brightest fluorescent cytidine analogues based on quantum yields. RNA containing PhpC was cleaved by HIV-1 RT RNase H with a 14-fold increase in fluorescence intensity. In contrast / La transcriptase inverse (RT) du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) possède deux activités: polymérase et ribonucléase H (RNase H), en faisant l'enzyme clé pour le cycle de vie du VIH puisqu'elle convertit l'ARN viral génome en ADN à double brins. Des études portant sur des acides nucléiques modifiés chimiquement sont ici décris afin de: (1) mieux comprendre les procédés biochimiques sous-tendant la transcription inverse du VIH-1, (2) synthétiser des agents antirétroviraux dirigés contre de nouvelles cibles de la RT, et (3) développer des méthodes de criblage incorporant des analogues de nucléobase fluorescente afin de découvrir de nouveaux candidats thérapeutiques. Nous avons ainsi démontré comment de petits acides nucléiques modifiés (épingles) inhibent l'activité RNase H de la RT VIH-1. La substitution de l'ARN naturel par des acids nucléiques modifiés chimiquement ont modulé la puissance de l'épingle face à l'activité de la RNase H. Des méthodes biochimiques ont démontré que le substrat de la RT VIH-1 peut être lié au domaine polymérase lorsque sa trajectoire est déviée du domaine RNase H par la présence d'épingles. Cette découverte supporte le modèle selon lequel l'activité de RNase H représente une cible antirétrovirale indépendante du reste de la RT. Nous avons synthétisé la 6-phénylpyrroloribocytidine (PhpC), un nouvel analogue fluorescent de la cytidine incorporé dans l'ARN. Cet ARN contenant de la PhpC a formé des structures ressemblant à des brins doubles natifs ayant des branches complémentaires et est reconnu par fluorométrie après liaison à une branche d'ARN ou d'ADN complémentaire. Se basant sur son rendement quantique, la PhpC se révéla un des analogues fluorescents de la cytidine les plus lumineux. Mais encore, l'ARN contenant de la PhpC fût coupé par la RNase H de la RT VIH-1, augmentant quatorze fois l'intensité de la fluorescence. Contrairement aux mêmes ol
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.94986 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Wahba, Alexander |
| Contributors | Masad J Damha (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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