L'activité des cotransporteurs K-Cl (KCC1 à 4) est modulée par des changements de concentration en Cl ([Cl]) et du volume cellulaire. Les voies signalétiques d'activation ou d'inhibition des KCCs impliquées suite à de tels changements sont encore inconnues. Selon plusieurs études effectuées avec des agents pharmacologiques, le cotransport K-Cl serait activé par déphosphorylation des transporteurs et vice versa. Toutefois les enzymes régulatrices et les domaines KCCs avec lesquels elles interagissent ne sont pas encore élucidés quoiqu'il ait été rapporté que le C-terminus (Ct) de ces transporteurs semble jouer un rôle fonctionnel important à cet égard. D'autre part, nous avons récemment trouvé que l'activité de KCC2 et KCC4 est inhibée par le 4p-phorbol 12-myristate 13-acetate ou PMA, suggérant une régulation par la protéine kinase C (PKC). Les objectifs de cette thèse étaient donc d'analyser le rôle du Ct dans la régulation des KCCs en réponse aux changements de tonicité ou de [Cl] et au PMA, d'identifier des sites potentiels de phosphorylation par la PKC dans la structure des KCCs et de faire des études in vitro pour vérifier si les changements de tonicité ou de [Cl] et si l'effet du PMA s'accompagnent de changements dans le degré de phosphorylation des KCCs. L'approche privilégiée a été de générer des protéines chimériques KCC2-KCC4 dans lesquelles j'ai échangé 3 domaines du Ct (proximal, central et distal) et des mutants ponctuels dans lesquels j'ai supprimé les sites potentiels de PKC dans les domaines cytsoliques de ces transporteurs, et de déterminer l'impact de ces changements sur l'activité des transporteurs et leurs niveaux de phosphorylation. Plus spécifiquement, les protéines modifiées (n =19) et sauvages (n = 2) ont été exprimées dans les oocytes du xénope et l'activité de transport a été déterminée en mesurant l'influx en 86Rb et les niveaux de phosphorylation ont été analysés avec du H332PÛ4 par autoradiographie et ce, dans différentes conditions (mentionnées ci-dessus). Mes travaux ont permis de démontrer pour la première fois que la configuration structurale adoptée par le Ct des KCCs joue un rôle clé dans la régulation de ces protéines en réponse au gonflement cellulaire ou à l'augmentation de l'activité PKC membranaire mais que ces changements sont en partie indépendants de l'état de phosphorylation des transporteurs. Ils ont permis également de démontrer de nouveaux mécanismes de régulation des KCCs bien distincts suite à des changements de volume cellulaire, un mécanisme indépendant de la phosphorylation qui permettrait d'activer le cotransport K-Cl suite au gonflement cellulaire et un mécanisme dépendant de la phosphorylation qui permettrait de supprimer le cotransport K-Cl suite au rétrécissement cellulaire.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/19173 |
| Date | 12 April 2018 |
| Creators | Bergeron, Marc |
| Contributors | Isenring, Paul |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | xi, 161 f., application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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