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Previous issue date: 2007 / Chromobacterium violaceum é uma bactéria Gram-negativa, pigmentada,
aeróbica facultativa, que vive em regiões de climas tropicais e subtropicais,
encontrada principalmente, em solos e rios. Seu potencial biotecnológico
demonstrado foi através do genoma seqüenciado da C. violaceum ATCC
12472, que apresentou genes desconhecidos relacionados à biossíntese de
quitina. Neste trabalho foi avaliada inicialmente a diversidade genética de
quatorze linhagens de C. violaceum de diferentes procedências, utilizando
métodos bioquímicos e moleculares, das quais duas foram selecionadas para
análise do sistema quitinolítico. As linhagens foram crescidas no meio Luria
Bertani (LB) e caracterizadas pelo perfil de ácidos graxos e do gene 16S rDNA,
e a diversidade genética, pela técnica de rep-PCR. Em seguida, foi realizada a
caracterização das linhagens de C. violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 para a
biossíntese de quitina, utilizando células crescidas em meio Luria Bertani (LB)
com e sem a presença de quitina coloidal 0,2%, sendo quantificada a atividade
quitinásica (gel de atividade e ensaios enzimáticos com dímero e trímero) e
proteínas totais. As amostras foram analisadas em gel de eletroforese SDSPAGE,
corados com Azul de Coomassie G-250 e os géis da atividade
quitinásica foram corados com calcofluor. Para a caracterização do gene de
quitinase foram utilizadas seqüências codificadoras de quitinase A e
endoquitinase (Cv1897 e Cv2736), utilizando-se o DNA genômico de C.
violaceum ATCC 12472 e UCP 1489 como molde na técnica de PCR (Reação
em Cadeia da Polimerase), usando oligonucleotídeos específicos. A
metodologia empregada envolveu o uso de ferramentas de bioinformática que
exploram informações do genoma, como estrutura dos genes, elementos de
regulação, domínios e motivos conservados. Os resultados do perfil de ácido
graxos e 16S rDNA permitiu a caracterização das linhagens e o rep-PCR
demonstrou que as linhagens estudadas apresentam uma diversidade
genética. As linhagens de C. violaceum selecionadas apresentaram um perfil
diferenciado de atividade quitinolítica em gel desnaturante com a presença de
glicol quitina. Nos ensaios com os substratos sintéticos (N,N - diacetilquitobiose
e N, N , N -triacetilquitotriose), verificou-se que houve atividade para ambos ossubstratos. Os resultados indicaram que os maiores valores da atividade
quitinolítica foram observados usando-se o cromóforo diacetilquitobiose. A
seqüência codificadora do gene CV1897 (endoquitinase) apresentou 439
aminoácidos, correspondendo ao domínio quitinase (CDD:29557) da família 19
da glicosil hidrolase (257 aminoácidos), formada por enzimas que catalisam e
hidrolisam as unidades β-1,4-N-acetil-D-glucosamina ligadas no polímero de
quitina. Além desta região, as bases restantes proporcionaram a formação de
dois sítios, um putativo para a construção de açucares e outro constituído por
resíduos catalíticos. A seqüência correspondente ao produto do gene Cv2935
sugere uma provável quitinase A no genoma de C. violaceum ATCC 12472
(BrGene), sendo formada por 439 aminoácidos. Observou-se duas regiões: i) a
ChtBD3 como um domínio obrigatório para quitina tipo 3 (29..73) e CDD:47799;
ii) a quitinase A com um CDD: 33272 responsável pelo transporte e
metabolismo de carboidratos (109..419), pertencente a família 18 da glicosil
hidrolase. Os resultados obtidos caracterizaram a C. violaceum UCP 1489 com
alta identidade com a linhagem ATCC 12472, demonstrando também, ambos
aspectos biotecnológico de produção das enzimas quitinase A (exoquitinase)
da família 18 e a endoquitinase da família 19
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/2124 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Luiza Ribeiro Bastos da Silva, Maria |
| Contributors | Maria de Campos Takaki, Galba |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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