Las cianobacterias tienen potencial como productoras de biocombustibles y otros
productos químicos, ya que pueden crecer utilizando el CO2 presente en la atmósfera
como fuente de carbono, la luz como fuente de energía y el agua como fuente de
electrones. Esto resulta atractivo en el contexto actual de cambio climático ocasionado
por las elevadas concentraciones de CO2 en la atmósfera. En esta tesis se estudia la
producción de etanol de cuarta generación y polihidroxibutirato (PHB) a partir de la
cianobacteria Synechocystis sp. PCC 6803, con un enfoque de Ingeniería de Sistemas
Metabólicos.
En primer lugar, se cura un modelo estequiométrico de escala genómica (GEM) de dicha
cianobacteria con información bibliográfica específica actualizada, con el objetivo de
mejorar las predicciones in silico. Luego, el GEM es validado frente a datos
experimentales fisiológicos y datos de fluxómica, demostrándose que la curación resulta
efectiva en mejorar las predicciones del modelo. Con el modelo curado y validado, se
formulan problemas de programación binivel para buscar estrategias de acoplamiento,
a través de la supresión de genes, entre el crecimiento y la producción del compuesto
de interés con el objetivo de convertir al metabolito deseado en un subproducto obligado
del crecimiento y que en consecuencia, su producción resulte una parte integral de la
función metabólica del organismo. Matemáticamente, las intervenciones genéticas se
representan por medio de variables binarias asociadas a dichos genes. Estos problemas
son reformulados por medio de la teoría de la dualidad, obteniéndose como resultado
problemas de programación mixta entera lineal (MILP) en un solo nivel que se resuelven
tanto para el caso de etanol como para el de PHB. Existen en bibliografía formulaciones
de este tipo, aunque con variables binarias asociadas a reacciones. El aporte realizado
en esta tesis al incorporar asociación de variables binarias a genes es un avance en el
agregado de información biológica a este tipo de formulaciones.
En el caso del etanol se obtienen dos mutantes factibles que presentan diferentes
estrategias de intervención para acoplar la producción al crecimiento, una relacionada
con la producción de acetato y la otra, con el balance celular de poder reductor, siendo
el segundo caso el más prometedor desde el punto de vista biotecnológico ya que
aumenta en un 235 % la productividad de la cepa con respecto a las productividades
presentadas en bibliografía. Para este producto, también se estudia la posibilidad de
producción con una estrategia en dos etapas. En dicha estrategia, se considera un
primer biorreactor con condiciones que maximicen el crecimiento y un segundo
biorreactor donde un nutriente limita dicho crecimiento y se favorece la producción de
etanol. Esta estrategia mejora aún más los índices de producción.
En el caso de PHB también se obtienen dos mutantes factibles, pero la estrategia de
acoplamiento no varía. La diferencia entre ambos son dos intervenciones más, que
hacen que la tasa de producción de PHB aumente un 25%. La estrategia, en este caso,
también está relacionada con el balance de poder reductor de la red, pero se observan
mayores cambios en los flujos metabólicos internos que para el caso del etanol. La
productividad del mejor mutante se analiza en condiciones de exceso y de limitación de
nutrientes.
Las productividades obtenidas vuelven atractiva la realización de experimentos in vivo
para avanzar en el diseño de cepas de Synechocystis como fábricas celulares de etanol
de cuarta generación y de bioplásticos.
Los modelos desarrollados constituyen herramientas útiles para el diseño de cepas
industriales para la producción fotosintética no solo de biocombustibles y bioplásticos,
sino también de compuestos de interés en una gran variedad de industrias como la
farmacéutica, la nutracéutica, de biofertilizantes, entre otros. / Cyanobacteria are potential candidates for biofuel and chemical product production, due
to their ability to grow autotrophically, on the atmospheric CO2 as carbon source, light as
energy source, and water as electron source. These capacities become attractive in the
current climate change context, caused by the high concentrations of CO2 in the
atmosphere. In this thesis, the production of fourth generation ethanol and
polyhydroxybutyrate (PHB) from the cyanobacteria Synechocystis sp. PCC 6803 is
studied through a Systems Metabolic Engineering approach.
First, a genomic scale stoichiometric model (GEM) of Synechocystis is curated, based
on specialized and actualized bibliography, to improve the in silico predictions. Then, the
GEM is validated against physiological and fluxomic data. After model curation and
validation, bilevel programming problems are formulated, to determine genetic
engineering strategies to couple growth and bioproduct production by gene knock-outs.
The aim of coupling production is turning the biotechnological compound into an obligate
subproduct of growth, so that its production becomes an integral part of the organism’s
metabolic function. Mathematically, knock-outs are represented by binary variables
associated to the corresponding genes. This bilevel programming problems are
reformulated into one level Mixed Integer Linear Programming (MILP) problems by
applying the duality theory, and are solved for both ethanol and PHB cases. Considering
binary variables associated with genes instead of reactions is a novel contribution of this
thesis. and constitutes a step towards the incorporation of biological meaning into in silico
results.
For the case of ethanol, two feasible mutants are obtained, with different intervention
strategies to couple production to growth. One of the strategies is related to acetate
production and the other with the cellular reductive power balance. The latter is the most
promising case from a biotechnological point of view, because it gives a productivity
235%.higher than those reported in bibliography. Also, a two-stage ethanol production
strategy is addressed, where a first bioreactor with growth maximizing conditions and a
second one with nutrient limiting conditions are considered. This strategy further
improves production indexes.
In the case of PHB, two feasible mutants are obtained with similar coupling strategies.
The difference between them are two interventions that improve PHB production rate by
25%. The strategy in this case is also related with the cellular reductive power balance,
but more changes in the internal metabolic fluxes are required, as compared to the
ethanol case. The productivity of the best mutant is analyzed under excess and limiting
nutrient conditions. The results obtained are encouraging to make further in vivo
experiments to move forward in the design of Synechocystis as a microbial cell factory
of fourth generation biofuels and bioplastics.
The models developed in this thesis constitute useful tools for the design of industrial
strains for the photosynthetic production of not only biofuels and bioplastics, but also of
compounds of interest with application in a wide range of industries like pharmaceutical,
nutraceutical and biofertilizers, among others
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/4881 |
| Date | 17 March 2020 |
| Creators | Lasry Testa, Romina D. |
| Contributors | Díaz, María Soledad, Estrada, Vanina G. |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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