A Proteína Dissulfeto Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1), pertencente à superfamília das
tiorredoxinas, é uma tiol oxidorredutase que catalisa a oxidação e redução de tióis e a
isomerização de dissulfetos intramoleculares. Essa chaperona tem atividade dependente de
cisteínas presentes nos sítios ativos, e está presente no retículo endoplasmático (RE) e/ou na
membrana plasmática de células eucarióticas. Estudos anteriores da atividade catalítica de
PDI foram realizados utilizando-se como pseudo-substratos, entre eles, a di-eosinaglutationa
oxidada (Di-E-GSSG), que se mostrou ótima ferramenta para o monitoramento
da atividade de dissulfeto redutase da PDI. Nesse trabalho, a síntese e purificação
cromatográfica de Di-E-GSSG foram realizadas e a pureza da sonda foi verificada através
de cromatografia líquida de alta performance (CLAE). A cinética enzimática da atividade
redutase de PDI isolada recombinante sobre Di-E-GSSG foi estudada, caracterizando-se os
principais parâmetros físico-químicos da enzima através da formação do monômero
fluorescente (λexc=521nm; λemi=542 nm) eosina-glutationa reduzida (E-GSH). O valor da
constante de Michaelis-Menten (Km) encontrado foi de 520,5±129,8 nM, a velocidade
máxima de catálise (Vmáx) foi determinada como 1,637±0,1526 nM.min-¹ e a constante
catalítica (Kcat) encontrada foi 1,364 . 10-³.s-³. São relatados na literatura poucos compostos
químicos capazes de inibir a atividade catalítica da PDI. Assim, para verificar se compostos
radicalares estáveis desempenham essa atividade, foram testados nitróxidos piperidínicos
como possíveis inibidores de PDI. Esses compostos, que possuem propriedades
antioxidantes, antiinflamatórias e radioprotetoras, apresentam efeito “scavenger” sobre
diferentes espécies radicalares, dentre as quais, radicais tiila. O nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6-
tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol) mostrou-se um inibidor pouco potente da atividade
redutase da enzima. Entretanto, três outros nitróxidos, sintetizados especificamente para
este trabalho, demonstraram maior poder de inibição, com uma correlação direta com o
aumento de hidrofobicidade das estruturas químicas dos mesmos. Essa capacidade de
inibição foi confirmada sobre a atividade de PDI presente em plaquetas humanas,
corroborando a hipótese de que os nitróxidos são candidatos a novos fármacos moduladores
de funções celulares onde esteja envolvida a atividade de PDI. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) belonging to the thioredoxin superfamily, is a
thiol oxidoreductase that catalyzes the oxidation and reduction of thiols and intramolecular
disulfide isomerization. This chaperone, such activity is dependent of cysteine located on
the active sites, is present in the endoplasmic reticulum (ER) and / or plasma membrane of
eukaryotic cells. Previous studies of the catalytic activity of PDI were performed using
different pseudo-substrates, among them, the di-eosin-glutathione disulfide (Di-E-GSSG),
described as a usefull tool for monitoring the disulfide reductase activity of PDI . In this
work, the synthesis and chromatographic purification of Di-E-GSSG were performed and
the purity of the probe was verified by high performance liquid chromatography (HPLC).
The enzyme kinetics of the reductase activity of recombinant PDI isolated over Di-E-GSSG
was studied, characterizing the main physicochemical parameters of the enzyme through
the formation of the fluorescent monomer (λexc=521nm; λemi=542nm) eosin-reduced
glutathione (E-GSH). The value of the Michaelis-Menten constant (Km) was found to be
520.5 ± 129.8 nM, the maximum velocity of catalysis (Vmáx) was determined as 1,637 ±
0.1526 nM.min-¹ and the catalytic constant (Kcat) found was 1.364 . 10-³.s-¹. Few chemical
compounds able to inhibit catalytic activity of PDI were reported. Thus, to verify if stable
free radical compounds display this activity were tested piperidine nitroxides as potential
inhibitors of PDI. These compounds, which have antioxidant, anti-inflammatory and
radioprotective properties are “scavengers” of different radical species, among them, thyil
radicals. The nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametilpiperidine-1-oxyl (Tempol) was a weak
inhibitor of PDI reductase activity. However, three other nitroxides specifically
synthesized for this study showed higher inhibition power, with a direct correlation
between increasing the hydrophobicity of the chemical structures and inhibitory action.
This ability was confirmed by assays with PDI found in human platelets, confirming the
hypothesis that the nitroxides are candidates for new drugs to modulate cellular functions
involving the PDI activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.254.254.39:tede/723 |
| Date | 07 December 2010 |
| Creators | OLIVEIRA, Altamir Fernandes de |
| Contributors | BRIGAGÃO, Maísa Ribeiro Pereira Lima, http://lattes.cnpq.br/0963588859777460, D'ASSUNÇÃO, Lázaro Moscardini, FLORENZANO, Fábio Herbst |
| Publisher | Universidade Federal de Alfenas, Instituto de Química, Brasil, UNIFAL-MG, Programa de Pós-Graduação em Química |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UNIFAL, instname:Universidade Federal de Alfenas, instacron:UNIFAL |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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