A citricultura se destaca como uma das mais importantes atividades do agronegócio brasileiro, sendo o estado de São Paulo o principal produtor mundial de laranja e o maior exportador de suco concentrado e congelado. O psilídeo dos citros (Diaphorina citri) tornou-se nos últimos anos um dos mais importantes vetores na cultura, devido à transmissão de \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' e \'Ca. L. americanus\', bactérias associadas ao huanglongbing (HLB), principal doença da citricultura atual. Uma vez que não há variedades comerciais de citros resistentes ao HLB, seu manejo é baseado no uso de mudas sadias, erradicação de plantas infectadas e pelo controle químico do vetor. No entanto, o custo elevado e os significativos danos ambientais causados pelos inseticidas químicos, associados à possibilidade da seleção de populações de psilídeos resistentes a esses produtos, têm levado à busca por estratégias alternativas de manejo do vetor do HLB que sejam mais adequadas e sustentáveis. Nosso grupo tem tentado contribuir nesse sentido, com a prospecção e caracterização de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) patogênicos ao psilídeo. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (a) Confirmar a capacidade endofítica e a patogenicidade de estirpes de Bt em seedlings e mudas de citros com diferentes combinações de copa/porta-enxerto; (b) Determinar a concentração letal (CL50) necessária para ocasionar mortalidade em populações de D. citri; (c) Estudar a interação entre toxinas Cry e receptores de membrana do intestino de ninfas e (d) Avaliar a compatibilidade das estirpes selecionadas com agrotóxicos comumente utilizados na citricultura. Os bioensaios realizados com seedlings e mudas de citros demonstraram que as estirpes de Bt (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 e S1989) translocaram endofiticamente nas plantas, mantendo sua viabilidade e, em sua maioria, o potencial patogênico para ninfas de D. citri. Para seedlings, os valores de mortalidade passaram de 80% para as estirpes S1302 e S1450. Foram observados esporos e células vegetativas de B. thuringiensis subsp. kurstaki expressando green fluorescent protein (Btk::GFP), visualizados por microscopia de fluorescência, aderidos principalmente aos elementos de vasos e no xilema, obtidas de amostras seccionadas transversal e longitudinalmente, de caule e raiz de seedlings e mudas de laranjeira Pera. A CL50 e CL80 para a estirpe S1302 foi de 4,92 × 104 esporos/mL e 6,63 × 107 esporos/mL, respectivamente. Já para a estirpe S1450, 50% de mortalidade das ninfas testadas foi estimada em 2,19 × 104 esporos/mL, e a CL80 foi de 6,18 × 108 esporos/mL, quando utilizadas suspensões de esporos da bactéria diretamente no substrato de seedlings de laranjeira Pera. Os ensaios de ligação demonstraram que todas as toxinas Cry presentes nas estirpes S1302, S1450 e S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B e Cry11) interagiram com os receptores de membrana intestinal, brush border membrane vesicles (BBMV\'s), obtidos de ninfas de D. citri. Ensaios in vivo evidenciaram que as estirpes S1302 e S1450 mostraram-se compatíveis com todos os agrotóxicos comumente utilizados na citricultura, ainda que os produtos à base de cobre e o inseticida Dimetoato tenham sido deletérios em aplicações diretas na bactéria in vitro. Esses dados evidenciam a possibildade do uso de Bt como bioinseticida no manejo integrado do HLB. / Citriculture is one the most important activities of Brazilian agribusiness, and the State of São Paulo being the world\'s leading orange producer and the largest juice exporter. Asian citrus psyllid - ACP (Diaphorina citri) has become one of the most important vectors in the citriculture in recent years, due to the transmission of \'Candidatus Liberibacter asiaticus\' and \'Ca. L. americanus\', bacteria associated with huanglongbing (HLB), the main citrus disease worldwide. Nowadays there are no commercial citrus varieties resistant to HLB, and its management is based on the use of healthy nursery citrus trees, eradication of symptomatic planst from the orchards, and vector chemical control. However, excessive cost and environmental damage due to application of chemical insecticides associated with the possibility of selection of ACP resistant populations, have led researchers to persue alternative strategies for the management of HLB. Our group has contributed with the screening of Bacillus thuringiensis (Bt) strains with potential against ACP. Therefore, our objectives were: (a) to confirm Bt endophytic translocation in citrus seedlings and nursery trees with different scion-rootstock combinations and to evaluate their pathogenicity against D. citri; (b) to estimate the lethal concentration (LC50 and LC80) to D. citri nymphs; (c) to study the interaction between Cry toxins and brush border membrane vesicle (BBMV) of the midgut D. citri nymphs, and (d) to evaluate the compatibility of pesticides with the selected Bt strains. The bioassays with citrus seedlings and nursery trees demonstrated that the Bt strains (Cyt1A, Cry2Aa, Cry4A, Cry10, Cry11, S1302, S1450 and S1989) translocated from roots to young leaves, maintaining their viability and pathogenicity against D. citri nymphs. For the seedlings, we found mortality values up to 80% for strains S1302 and S1450. Btk::GFP spores and vegetative cells were visualized by fluorescence microscopy in citrus seedlings and nursery trees adhered mainly to vessels and xylem, from roots to stems, in cross-section analyses. LC50 and LC80 for strain S1302 were 4.92 × 104 spores/mL and 6.63 × 107 spores/mL, respectively. For strain S1450, 50% mortality of nymphs tested was estimated at 2.19 × 104 spores/mL, and LC80 was 6.18 × 108 spores/mL, when bacterial spore suspensions were applied to citrus seedlings. Binding assays demonstrated that all Cry toxins present in strains S1302, S1450 and S1989 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry2Aa, Cry2Ab2, Cry1B and Cry11) interacted with the BBMV obtained from D. citri nymphs. In vivo assays showed that strains S1302 and S1450 were compatible with all pesticides commonly used in citrus orchards, althoug copper-based pesticides and dimethoate insecticide were incompatible in vitro with Bt strains. Our results demonstrate the potential of using Bt as systemic bioinsecticide in the future in HLB management.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01082018-182654 |
| Date | 03 April 2018 |
| Creators | Cunha, Tatiane da |
| Contributors | Astúa, Juliana de Freitas, Miranda, Marcelo Pedreira de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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