Kapsaicinoider är ämnen som finns i chilifrukterna och har på senaste tiden fått intresse som läkemedel på grund av sina analgetiska, anti-inflammatoriska och anti-cancer egenskaper. Ett nytt tillvägagångssätt att producera kapsaicinoider kan vara syntesen i rekombinant Saccharomyces cerevisiae med hjälp av metabolisk engineering och rekombinant DNA-tekniker. Gener från Capsicum chinensis, som kodar för enzymerna capsaicinoid-syntas (CS) och acyl-CoA-syntas (ACS), integrerades i S. cerevisiae i tidigare projekt. Den kända laboratoriesträngen CEN.PK modifierades med plasmidtransformation och för vildtyp-stammen ERF 5273 användes den nya CRISPR/Cas9-tekniken. Syftet med detta projekt är att ytterligare karakterisera och jämföra dessa tidigare konstruerade stammar angående deras förmåga att producera nonivamid eller andra jästspecifika kapsaicinoider. Vidare undersöks huruvida kapsaicinoider utsöndras i odlings-medium eller om de ackumuleras intracellulärt. Stammarna odlades i en bioreaktor i lite laboratorieskala. Som odlingsmedium används ett definierat medium med eller utan tillsatser. Odlings-medium kompletterades med vanillyl-amin och nonanoic acid som precursor. För att identifiera de kapsaicinoid-producerande stammarna extraherades supernatanten och cellpelleten och analyserades kromatografisk med HPLC. Resultaten från denna studie visade att jäststammarna, som innehöll båda generna (ACS + CS), sannolikt producerade nonivamid om de odlades i kompletterat medium. Vidare observerades bildning av nonivamid som ackumulerades i själva cellen. Möjligtvis producerades också jästspecifika kapsaicinoider, men topphöjden är nästan inte mätbar. Därför måste dessa resultat bekräftas ytterligare. Framtida arbeten behövs för att säkerställa och förbättra produktionen av kapsaicinoider. Keywords: acyl-CoA syntas, kapsaicinoider, kapsaicinoid syntas, metabolisk engineering, Saccharomyces cerevisiae, nonivamide / Capsaicinoids are compounds found in chili plants and have recently gained interest as pharmaceuticals due to their analgesic, anti-inflammatory and anti-cancer properties. A novel approach producing capsaicinoids could be synthesis in recombinant Saccharomyces cerevisiae with help of metabolic engineering. Genes from Capsicum chinensis, encoding the enzymes capsaicinoid synthase (CS) and acyl-CoA synthase (ACS), were previously inserted into S. cerevisiae. The known laboratory stain CEN.PK was modified with plasmid transformation and the novel CRISPR/Cas9 technology was used for the wild type strain ERF 5273. The aim of this project is to further characterize and compare these previously constructed strains concerning their ability to produce nonivamide or yeast specific capsaicinoids. Furthermore, it is examined whether capsaicinoids are excreted into the broth or accumulated intracellularly. Four different strains were cultivated in bench-scale bioreactors using medium supplemented with or without different precursors (vanillylamine and nonanoic acid). Culture broth supernatants and cell pellets were extracted and analyzed by HPLC in order to identify the capsaicinoid-producing strains. The results from this study revealed that the yeast strains harbouring both genes (ACS+CS) produced most likely nonivamide if they were cultivated in media supplemented with both precursors. Nonivamide formation was equally observed in broth supernatant and cell pellet. Additionally it was shown that yeast specific capsaicinoid production occured, althoug the peak height was close to the limit of detection and these results have to be confirmed further. Future work needs to be done in order to ensure and improve capsaicinoid production. Keywords: acyl-CoA synthase, capsaicinoids, capsaicinoid synthase, metabolic engineering, Saccharomyces cerevisiae, nonivamide.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:mau-27076 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Lentmaier, Claudia |
| Publisher | Malmö universitet, Fakulteten för hälsa och samhälle (HS), Malmö universitet/Hälsa och samhälle |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0573 seconds