Doctor en Bioquímica / Acidithiobacillus ferrooxidans es una bacteria extremófila de gran importancia
industrial debido a su participación en la recuperación de metales como cobre, oro
y uranio en biominería. Esta bacteria puede resistir altas concentraciones de cobre
y otros metales, característica fundamental para sobrevivir a las condiciones de la
biolixiviación de minerales.
La presencia en A. ferrooxidans ATCC 23270 de determinantes de resistencia a
cobre canónicos (bombas de eflujo, chaperonas que unen cobre, etc) no explican
completamente cómo esta bacteria resiste concentraciones de cobre extremas,
sugiriendo la existencia de otros mecanismos de resistencia al metal.
Para identificar nuevos posibles determinantes de resistencia en este
microorganismo, se evaluó los niveles de síntesis de proteínas por análisis
proteómico por electroforesis bidimensional (IEF-SDS PAGE) y también se
determinó los niveles de mRNA de algunos genes que codifican estos
determinantes por PCR en tiempo real (qRT-PCR). Además, mediante proteómica
cuantitativa por ICPL (isotope-coded protein labeling) se identificó 366 proteínas de
las que 47 cambian sus niveles de síntesis en células crecidas en azufre en
presencia de cobre, mientras que en hierro se identificó 594 proteínas de las que
120 cambian en presencia del metal. Mediante esta estrategia se identificó la
sobreexpresión de proteínas de membrana que forman parte de un sistema Cus y
un sistema de eflujo del tipo RND diferente en A. ferrooxidans crecidos en presencia
de cobre, sugiriendo un eflujo dinámico de cobre a través de las membranas.
Además se observó la sobreexpresión de la mayoría de los genes involucrados en la síntesis de histidina y de varios genes que participan en la síntesis de cisteína,
indicando una posible función de estos aminoácidos que unen metales en la
destoxificación del cobre intracelular. También se detectó el aumento en la síntesis
de una posible disúlfuro isomerasa periplasmática, indicando que esta proteína
repararía puentes disúlfuro dañados para permitir la supervivencia celular en
condiciones de estrés. Por otro lado, se observó la represión de la porina de
membrana externa más abundante de A. ferrooxidans (Omp40) y de otros canales
iónicos, lo que sugiere una disminución del influjo del metal hacia el interior de la
célula.
Finalmente, se identificó en A. ferrooxidans crecidos en azufre y en presencia de
cobre un incremento en la síntesis de algunas proteínas relacionadas con la
formación de biopelículas. Esto sugiere que el crecimiento de la bacteria adherida
a un medio sólido mejoraría la resistencia al cobre del microorganismo.
Los resultados obtenidos indican que A. ferrooxidans usaría no sólo estrategias
canónicas de resistencia a cobre como sistemas del tipo RND, sino que también
mecanismos adicionales en los que varias proteínas de la envoltura celular y
citoplasmáticas serían componentes principales.
Por medio de este trabajo se identificó nuevas proteínas que participarían en la
resistencia a cobre en A. ferrooxidans contribuyendo a mejorar el conocimiento
sobre los mecanismos de resistencia a este metal de esta bacteria, lo que podría
proporcionar las herramientas para optimar la resistencia a cobre de otros
microorganismos biomineros y la eficiencia del proceso de biolixiviación / Acidithiobacillus ferrooxidans is an extremophilic bacterium of great industrial
importance due to its participation in the recovery of metals such as copper, gold
and uranium through biomining. This bacterium is able to resist high copper and
other metal concentrations, an essential property to survive the environmental
conditions during industrial ore bioleaching.
The presence in A. ferrooxidans ATCC 23270 of canonical copper-resistance
determinants (efflux pumps, metal chaperones, etc) do not fully explain how this
bacterium is able to resist extreme copper concentrations, suggesting the existence
of other mechanisms of resistence.
To identify new possible copper resistance determinants in A. ferrooxidans ATCC
23270, levels of protein synthesis were determined by proteomic analysis through
two-dimensional electrophoresis (IEF-SDS PAGE). In addition, the RNA levels of
some genes encoding these putative resistence determinants was also measured
by real-time PCR (qRT-PCR). Furthermore, through quantitative ICPL (isotopecoded
protein labeling) proteomics 366 proteins we identified of which 47 changed
their levels of synthesis in cells grown in sulfur in the presence of copper while in
iron grown cells 594 proteins were identified. One hundred and twenty of then
changed their levels in the presence of copper. Using this strategy the up-regulation
of membrane proteins that are part of RND-type Cus systems and new different
RND-type efflux pumps were identified in A. ferrooxidans grown in the presence of copper, suggesting a dynamic metal efflux through the membranes. Furthermore,
the overexpression of most genes involved in histidine biosynthesis and several
genes involved in the biosynthesis of cysteine was observed, suggesting a possible
role of these metal-binding amino acids in detoxifying of intracellular copper. In
addition, the up-regulation of a putative periplasmic disulfide isomerase was also
seen in the presence of copper, suggesting that this protein would restore damaged
disulfide bonds to allow cell survival in stress conditions. On the other hand, the
down-regulation of the major outer membrane porin (Omp40) and some ionic
transporters observed in A. ferrooxidans grown in the presence of copper indicated
a general decrease in the influx of the metal and other cations into the cell.
Finally, in A. ferrooxidans grown in sulfur and in the presence of copper, an increase
in the synthesis of some proteins related to biofilm formation was found. This
suggests that growth of bacteria adhered to a solid medium may enhance copper
resistance of this microorganism.
The results indicate that A. ferrooxidans would use not only canonical strategies of
resistance to copper such as RND-type systems, but also additional mechanisms
where several proteins of the cell envelope and cytoplasm would be main
components.
Through this work we identified novel proteins that participate in copper resistance
in A. ferrooxidans contributing to a better understanding of the mechanisms of
copper resistance of this bacterium, which could provide the tools to improve copper
resistance to other biomining microorganisms and bioleaching process efficiency / Conicyt
Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/116940 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Almárcegui Zamorano, Rodrigo Javier |
| Contributors | Jerez Guevara, Carlos, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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