The present study exploits two different molecules as biorecognition elements for biosensing. In the first case, a protein biosensor was performed using maltose-binding protein (MBP). The ability to manipulate protein function rationally also offers the possibility of creating new proteins of biotechnological value. Our design has been used to test the understanding of allosteric transitions in proteins. Here we examined a simple conformational change that can represent the biorecognition principle for a reagentless biosensor. Previously, modular strategies for transducing ligand-binding events into fluorescent and electrochemical responses have been reported. Starting with a study of the conformational changes of MBP this research will further develop electrochemical maltose biosensors. The responses of four individual mutations (K46C-MBP-MT, N282C MBP-MT, Q72C-MBP-MT; and K25C-MBP-MT) were evaluated using square wave voltammetry. The possibility of using this type of transduction mechanism for sensor configurations and analyte specificity is discussed.The second part of this work involves SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) and aptamers as biorecognition molecules. As a result of the SELEX method, we can obtain oligonucleotide sequences (aptamers) with recognition properties similar to antibodies. These synthetic elements play an important role in molecular recognition because of their capability for specifically binding of a target molecule. A new approach for the separation step has been performed, termed Soluble-SELEX. This new SELEX method uses hybridization as partitioning mechanism for separating the bound and unbound DNA members from the target-molecule. Hybridization procedure has been evaluated by fluorescence studies as partitioning mechanism for SELEX method. Herein, we exploited the incorporation of an aptamer for biosensing detection of a specific target molecule. Three different transduction methods such as fluorescence, electrochemistry and surface plasmon resonance (SPR) were evaluated. In all three cases, the biosensing procedure was successful.In conclusion, this research has evaluated the translation of a fluorescent biosensor into an electrochemical biosensor using maltose-binding protein as biorecognition element. On the other hand, a new SELEX method has been developed. However, future improvements are required in order to optimize the method. As result of SELEX a new avidin-aptamer was selected and three different transduction systems were employed to construct fluorescent, surface Plasmon resonance and electrochemical biosensors. / El presente estudio utiliza dos moléculas diferentes como elementos de bioreconocimiento. En el primer caso, un biosensor basado en proteínas fue desarrollado utilizando la proteína periplasmica de unión a maltosa (MBP = maltose-binding protein). La habilidad para manipular racionalmente la función de una proteína también ofrece la posibilidad de crear nuevas proteínas con valor biotecnológico. Nuestro diseño proteico ha sido usado para evaluar cambios alostéricos en proteínas. Este estudio evalúa un simple cambio conformacional el cual puede ser usado como el principio transductivo para un biosensor. Diferentes estrategias de transducción usando fluorescencia y electroquímica en eventos de reconocimiento entre la proteínas periplasmicas de unión y el ligando, han sido previamente reportadas. Esta investigación inicia con el estudio de los cambios conformacionales de MBP, continuando con el desarrollo de un biosensor electroquímico para maltosa. La señal de cuatro diferentes mutantes (K46C-MBP-MT, N282C MBP-MT, Q72C-MBP-MT; y K25C-MBP-MT) fue evaluada usando voltimetría de onda cuadrada. La posibilidad de usar este tipo de transducción mecánic (distancia) para la configuración de biosensores y la respectiva especificidad analítica es discutida. La segunda parte de este trabajo incluye el método SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) y aptameros como moléculas de bioreconocimiento. Como resultado de el método SELEX, podemos obtener secuencias de oligonucleótidos (aptameros) con propiedades de reconocimiento similares a los anticuerpos. Estos elementos sintéticos, tienen un importante rol en el reconocimiento molecular por su capacidad de unión específica a la molécula blanco. Un nuevo mecanismo para el paso de separación ha sido realizado, y llamado SELEX-Soluble. Este nuevo método SELEX usa la hibridización como mecanismo de separación para dividir los oligonucleótidos de DNA que no se unen y los que se unen a la molécula blanco. El procedimiento de hibridización y su uso como mecanismo de separación en el método SELEX ha sido evaluado a través de estudios de fluorescencia. Este estudio también explora la incorporación de un aptamero como elemento de reconocimiento en un biosensor. Tres diferentes mecanismos de transducción has sido evaluados: fluorescencia, electroquímica y resonancia de plasmon superficial (SPR). En los tres casos una excelente señal fue reportada. En conclusión, esta investigación ha evaluado la transferencia de una biosensor de fluorescencia a un biosensor electroquímico, utilizando la proteína periplásmica de unión a maltosa como elemento de bioreconocimiento. De otro lado, un nuevo método SELEX ha sido desarrollado. Sin embargo, futuras mejoras son requeridas para optimizar el método. Como resultado del método SELEX realizado un nuevo aptamero para avidita ha sido seleccionado y tres diferentes sistemas de transducción ha sido empleado para construir tres diferentes biosensores (fluorescencia, electroquímica y SPR).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_URV/oai:www.tdx.cat:10803/8564 |
| Date | 23 October 2008 |
| Creators | Hernández Hincapié, Frank Jeyson |
| Contributors | Ozalp, Cengiz, O'Sullivan, Ciara, Katakis, Ioanis, Universitat Rovira i Virgili. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Rovira i Virgili |
| Source Sets | Universitat Rovira i Virgili |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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