Glicocorticoides (GCs) modulam a reprodução, interferindo na produção de hormônios gonadais, estradiol (E2) e progesterona (P4). Concomitantemente, E2 e P4 também influenciam a liberação de cortisol. Além disso, em altas concentrações os GCs interferem na via de sinalização da insulina prejudicando o funcionamento dos órgãos, incluindo os do sistema reprodutivo bem como a produção de P4 pelo corpo lúteo (CL). O CL utiliza glicose para manter sua atividade, e o cortisol interfere na via de sinalização da glicose em diversos tecidos, porém ainda não existem estudos quanto à sua atividade no CL canino, tampouco quanto à presença de genes relacionados à via de sinalização dos GCs neste órgão. Os objetivos deste estudo foram caracterizar a expressão dos genes relacionados à via de sinalização dos GCs e da insulina em CL de cadelas cíclicas e identificar expressão diferencial destes genes entre os dias 20 e 60 do diestro, que correspondem à fase final de crescimento do CL e à fase de regressão luteínica, respectivamente. Ainda, avaliar as concentrações basais de cortisol salivar (CS) e metabólitos fecais de glicocorticoides (MGFs) em diferentes dias do diestro (10, 20, 30, 40, 50 e 60) de cadelas cíclicas, comparando com os níveis de E2 e P4 já publicados; correlacionar os valores obtidos nas duas técnicas; e estabelecer um intervalo de valores basais de CS e MFGs para o diestro. Para esta pesquisa foram selecionadas 28 cadelas cíclicas saudáveis; foi realizado o sequenciamento de nova geração (RNA-Seq) dos CLs coletados de 18 animais em dias específicos do diestro (dia 10, 20, 30, 40, 50 e 60 pós-ovulação); das outras 10 cadelas foram coletadas amostras de fezes e saliva, durante todo o diestro, e realizada mensuração da concentração de MFGs e CS. Nos resultados de RNA-Seq foi identificada a expressão dos genes NR3C1, HSD11B1, HSD11B2, SLC2A4, INSR e IRS1. Os genes NR3C1 (p>0,3; FDRCortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 0,6) e SLC2A4 (pCortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq Cortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 0,02; FDRCortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 0,1) não apresentaram expressão diferencial no diestro. Os genes HSD11B1 (p=0,0001; FDR=0,0021), HSD11B2 (p=0,013; FDR=0,06), INSR (p=0,002; FDR=0,01) mostraram maior expressão no dia 20 do diestro, quando comparado ao dia 60. O gene IRS1 (p=0,0006; FDR= 0,006) estava mais expresso no dia 60 do diestro em relação do dia 20. As dosagens hormonais demonstraram que no dia 10 do diestro (CS=0,0656 ± 0,0237µg/dL e MGFs=110,41 Cortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 46,51pg/ng) as duas mensurações apresentaram concentrações menores que nos demais dias do diestro (CS=0,1027 Cortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 0,0496µg/dL e MFGs=220,22 Cortisol. Corpo lúteo. Insulina. Diestro. RNA-Seq 183,74pg/ng). A concentração média de CS=0,0972µg/dL (0,011-0,246µg/dL) e MFGs=189,875pg/ng (9pg/ng-1067,2pg/ng) foi definida para o diestro canino. Estes resultados sugerem que o CL canino também é influenciado pelo cortisol circulante da mesma forma que outros tecidos já estudados, podendo interferir na via de sinalização da insulina e, consequentemente, prejudicar seu funcionamento e o sucesso reprodutivo. Além disso, em relação aos resultados das dosagens hormonais, os níveis baixos de CS e MFGs no dia 10 do diestro corroboram com os achados em literatura e com a queda de E2 neste mesmo período, o que sugere uma associação entre a produção de ambos os hormônios. / Glucocorticoids (GCs) modulate reproduction by interfering in the gonadal hormones production, estradiol (E2) and progesterone (P4). Likewise, E2 and P4 influence release of cortisol. Furthermore, high concentrations of GCs may harm the functioning of organs, including reproductive organs and progesterone (P4) production by the corpus luteum (CL). CL utilizes glucose to maintain its own activity and cortisol interferes with the glucose signaling pathway in several tissues. Studies characterizing cortisol activity and expression of genes related to GC signaling pathways in canine CL are still scarce. The aims of this study were to characterize the expression of genes related to GCs and insulin signaling pathways in cyclic canine CL and to identify differential expression of these genes between day 20 and day 60 of diestrus which correspond, respectively to luteal final growth and regression phases. Moreover to evaluate the basal concentrations of salivary cortisol (SC) and fecal glucocorticoid metabolites (FGMs) on different days of diestrus (10, 20, 30, 40, 50 e 60) in cyclic bitches, moreover to compare E2 and P4 levels already published. As well as to correlate the values of SC and FGMs, and also to establish an interval of basal concentrations of SC and FGMs for diestrus. For this research 28 healthy cyclic bitches were selected; RNA-Seq of the corpora lutea from 18 animals on specific days of diestrus (day 10, 20, 30, 40, 50, 60) was made. Saliva and fecal samples were collected from the other 10 bitches during diestrus phase. Enzyme immunoassay was made to measure the concentrations of SC and FGMs. The RNA-Seq results identified the expression of the genes NR3C1, HSD11B1, HSD11B2, SLC2A4, INSR e IRS1. No difference on the expression of NR3C1 (p>0,3; FDR>0,6) and SLC2A4 (p>0,02; FDR>0,1) was observed during diestrus. Nevertheless HSD11B1 (p=0,0001; FDR=0,0021), HSD11B2 (p=0,013; FDR=0,06), INSR (p=0,002; FDR=0,01) showed a higher expression on day 20 of diestrus and the gene IRS1 (p=0,0006; FDR= 0,006) presented higher expression on day 60 of diestrus. Results related to hormonal evatuations showed lower SC and FGMs concentrations on day 10th (SC=0,0656 ± 0,0237µg/dL and FGMs=110,41 ± 46,51pg/ng) than on the other days of diestrus (SC=0,1027 ± 0,0496 µg/dL e FGMs=220,22 ± 183,74 pg/ng). Average concentrations of SC=0,0972µg/dL (0,011-0,246µg/dL) and FGMs=189,875pg/ng (9pg/ng-1067,2pg/ng) were defined for canine diestrus. These data suggest that canine CL is influenced by cortisol similarly to other tissues in which cortisol may interfere in the insulin signaling pathway and, consequently, its function. Besides that, lower levels of SC and FGMs on day 10th of the diestrus corroborate with the literature data and with the decrease in E2 production at the same period. This data suggest that the production of both hormones are associated.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052019-145846 |
| Date | 22 November 2018 |
| Creators | Maruyama, Arnaldo Shindi |
| Contributors | Keohane, Paula de Carvalho Papa |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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