A ampliação do conhecimento sobre as formas de comunicação, controle e regulação existentes em bactérias traz luz aos avanços no combate das infecções hospitalares que são responsáveis por inúmeros prejuízos relacionados à saúde pública em todo planeta. DUMOULIN et al (2013), descreveram o regulador transcricional (RT) ElrR, que regula positivamente a transcrição do gene elrA, um fator de virulência de Enterococcus faecalis. ElrA apresenta grande similaridade com as internalinas de Listeria monocytogenes, que facilitam a invasão da bactéria ao hospedeiro. ElrR é considerada como pertencente à família Rgg-like de RT exclusivo de bactérias Gram positivas. Por vários motivos a família Rgg foi inserida à superfamília RNPP, gerando a superfamília RRNPP de RT. Os RRNPP fazem parte de um sistema de regulação por quorum sensing (QS), um sistema de comunicação célula-célula dependente de densidade celular, com função associada na ativação ou inibição da expressão de proteínas relacionadas, dentre outros, à virulência, formação de biofilme e esporulação. Para a melhor compreensão do mecanismo de como ocorre a ativação da transcrição do fator de virulência ElrA, este trabalho apresenta resultados de expressão heteróloga em E. coli e purificação das proteínas ElrR e ElrA, bem como resultados de experimentos biofísicos que caracterizam algumas propriedades estruturais e biológicas destas proteínas. Utilizando técnicas de cromatografia, espectroscopia de dicroísmo circular (CD), anisotropia de fluorescência, espalhamento dinâmico de luz (DLS), cristalografia de raios X e ressonância plasmônica de superfície (SPR), foi possível a obtenção da estrutura tridimensional de ElrR e de indícios da interação com uma região de 25bp do DNA. Realizou-se ainda, em colaboração com Dra. Pascale Serror, a tentativa de obtenção da molécula autoindutora (AI) de ElrR. São apresentados primeiros resultados da obtenção heteróloga de ElrA, sua purificação e cristalização, com importantes características que permitirão a continuação da investigação deste fator de virulência. ElrR é composta somente por alfa-hélices e apresenta-se dimérico em solução. Apesar da similaridade estrutural dos RRNPP, a identidade da sequência entre ElrR e os outros membros é extremamente baixa, o que motivou a resolução das fases cristalográficas experimentalmente. A estrutura de ElrR apresenta-se similar às homólogas, porém, com maior interface de interação entre os protômeros, que formam o dímero. O sítio de ligação do AI, em ElrR, apresenta-se mais amplo, com cavidade maior que as demais estruturas estudadas, conservando vários dos resíduos apresentados nos homólogos que realizam a estabilização do AI. Os altos fatores de temperatura dos cristais de ElrR, adicionado a anisotropia dos átomos, de uma das estruturas obtidas, apresenta a grande flexibilidade desse RT. Os indícios de interação entre ElrR e DNA aqui apresentados, obtidos por SPR e anisotropia de fluorescência, apresentam que ElrR liga especificamente ao fragmento proposto do DNA, ainda na ausência do AI. A não cristalização do complexo (ElrR-DNA), adicionada a alta flexibilidade apresentada na estrutura e a instabilidade observada na ligação ao DNA (por SPR) apontam para a obrigatoriedade da molécula de regulação (AI) para que o complexo ElrR-DNA seja estável. / The enhancing of the knowledge about communication, control and regulation in bacteria bring possibilities on the advance of hospital-acquired infections control responsible for various prejudices related to public health worldwide. DUMOULIN, et al (2013) described ElrR, a transcriptional regulator (TR), that positively regulates transcription of the elrA gene, which codifies a virulence factor of Enterococcus faecalis. ElrA shows high similarity with Listeria monocytogeneses internalins, which facilitates host invasion by these bacteria. ElrR are considered belonging to Rgg-like TR family exclusive of Gram positive bacteria. Several reasons include the Rgg family into the RNPP superfamily, generating the RRNPP superfamily of TR. The RRNPP are controlled by a quorum sensing (QS) regulation system, a cell-cell communication system based on cellular density that activates or inhibits the expression of proteins related with virulence, biofilm formation, sporulation, and others. For a better understanding of the transcription activation mechanism of ElrA, this work shows ElrR and ElrA heterologous expression in E. coli and purification of these proteins, as well as biophysics assays to characterize some structural and biological features of both proteins. Using chromatography, circular dichroism (CD), fluorescence anisotropy, dynamic light scattering (DLS), X-ray crystallography and surface plasmon resonance (SPR) technics, it was possible to obtain the tridimensional structure of ElrR, and evidences of ElrR-DNA complex formation, confirming DNA interaction site of ElrR with a 25 bp fragment. In collaboration with Dr. Pascale Serror, we attempted to achieve the ElrR auto-induction (AI) molecule. Also, results of the heterologous obtainment of ElrA are presented, as well as ElrA purification and crystallization, presenting important characteristics which will allow the further investigation of this virulence factor in near future. ElrR is composed by alpha-helices presenting dimeric fold in solution. Despite the similarity between the RRNPP members, the low identity of ElrR to the other members motivates the experimental crystallographic phases solution. ElrR structure is very similar to the homologous structures, presenting a higher interface between the protomers that compose the dimer. Its AI binding site is wider than the other structures studied, conserving several amino acid residues presented at the homologous proteins, that stabilizes the AI molecule. High temperature factors of the amino acid residues showed in all the obtained ElrR crystallographic structures plus the anisotropy of the atoms in one of those structures show the high flexibility of this TR. The evidence of the ElrR-DNA complex presented in this study, obtained by SPR and fluorescence anisotropy, indicates that ElrR binds at the proposed DNA site even in the absence of the AI molecule. The failure to obtain the ElrR-DNA complex crystals added to the high flexibility presented at some places of the structure and the observed instability at the formed complex (observed at SPR) suggest the mandatory need of the AI molecule to create a stable ElrR-DNA complex.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-30012018-155152 |
| Date | 21 November 2017 |
| Creators | Michel Conrad Robert De Groote |
| Contributors | Ilana Lopes Baratella da Cunha Camargo, Antônio José da Costa Filho, Luciene Andrade da Rocha Minarini, João Renato Carvalho Muniz, Mario Tyago Murakami |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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