A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14082012-083511 |
| Date | 03 August 2012 |
| Creators | Martins, Carolina Scanavez |
| Contributors | Oliveira, Paulo Tambasco de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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