Les cyclines D jouent un rôle essentiel dans les mécanismes du cycle cellulaire. Cette famille de protéines est composée de trois membres (D1,D2,D3) qui partagent un domaine très homologue de la « cyclin box » (codée par les exons 1-3). Ce domaine est responsable de leur activité redondante dans la phosphorylation de la protéine du rétinoblastome lors de l'association avec les kinases cycline-dépendantes CDK4/6. Parmi les trois cyclines, la cycline Dl, bien que faiblement exprimée dans les lymphocytes, est la cycline la plus impliquée dans les cancers lymphoïdes ou elle aurait une fonction de facteur de transcription indépendante de Cdk. Etant donné qu'après stimulation antigénique, les lymphocytes T et B ont une capacité remarquable de division, essentielle à la génération d’une réponse immunitaire efficace, nous avons porté un intérêt particulier au rôle des cyclines D dans la lymphopoïèse. Pour étudier le rôle de la cycline Dl dans la différenciation des lymphocytes, nous avons utilisé des souris déficientes pour les exons 1,2,3 de la « cycline box » Dl mais conservé les exons 4 et 5. Étonnamment, ces souris présentaient des phénotypes très différents que nous avons subdivisés en quatre groupes. Dans le groupe I, les souris avaient un thymus réduit car la différenciation de la lignée lymphoide est bloquée à un stade très précoce, avec un faible nombre de cellules progénitrices (CLP) dans la moelle osseuse. Dans le thymus, les progéniteurs des thymocytes (ETP) étaient pratiquement absents et les précurseurs CD4CD8CD3 (TN) immatures essentiellement constitués par des cellules CD44*CD25 (TN1) et CD44*CD25+ (TN2) les plus immatures. De plus, les CD4*CD8* (DP) qui donnent naissance aux thymocytes matures CD4+ et CD8+ étaient présents en très faible quantité. Dans la moelle osseuse, on observe un blocage majeur dans la différenciation de la lignée B au stade pré-proB. Dans les ganglions, la forte réduction du nombre de lymphocytes T observée était liée au faible nombre d'ETP et à l’absence du récepteur aux chimiokines CCR7. Dans le groupe II, les souris présentaient une diminution moins sévère des ETP et une atrophie modérée du thymus. La différenciation était bloquée à un stade ultérieur, soit dans la transition des étapes TN3 à TN4. Dans la moelle osseuse, les lymphocytes B ont subi un blocage partiel au stade pré-proB et une réduction des cellules pré-B. Le nombre de CLP est également réduit, mais dans une moindre mesure que dans les souris du groupe I. dans les groupes III et IV, les souris ont une répartition normale des thymocytes mais présentaient une augmentation du compartiment ETP. Alors que les souris du groupe III contenaient un nombre normal de thymocytes, les souris du group IV présentaient une hyperplasie thymique. Par ailleurs, en comparaison avec des souris normales, bien que la différenciation des lymphocytes B soit normale, on observe dans les deux groupes une augmentation des CLP et des progéniteurs hématopoïétlque (LSK). L’implication de la cycline Dl dans la transition de G1 à S nous a conduit à analyser les divisions cellulaires in vivo. De manière surprenante, les souris du groupe I étaient fortement dépourvues de cellules en cycle dans tous les compartiments lymphoïdes, ce qui peut expliquer les blocages de la différenciation lymphoide. Par contre, dans les trois autres groupes, on observe une augmentation du nombre de divisions cellulaires. Ces résultats différents peuvent être dû à l'expression ou l'absence d'une protéine Dl tronquée qui contient cependant les exons 4-5. Alors que ces ARNm tronqués ne sont pas détectables dans les souris de groupe I, on observe des niveaux élevés d'expression dans les autres groupes. De plus, nous avons observé une corrélation entre l'absence d’expression des exons 4-5 et la très faible expression des gènes CCND2 et CCND3, ce qui attribue à cette protéine tronquée un rôle prépondérant dans la régulation des cyclines D et permet d’expliquer l'aplasie profonde et… / D Cyclins play an essential role connecting exogenous stimulation to the intrinsic cell cycle machinery. This family of proteins is composed of three members sharing a highly homologous domain, the cyclin box (coded by exons 1-3), which is responsible for their redundant role in the phosphorylation of the retinoblastoma protein upon association with cydin-dependent kinases Cdk4/6. Both mature T and B-cells have a remarkable division capability after antigen stimulation, essential to the generation of efficient immune responses, raising the interest of D Cyclins in lymphopoiesis. Cyclin Dl, although weakly expressed by lymphocytes, is the D Cyclin most commonly implicated in lymphoid cancers and as having a Cdk-independent transcriptional role. To study the role of Cyclin Dl, we used mice deficient for the Dl cyclin box but sparing exons 4-5. Surprisingly, individual mice have very different phenotypes that we subdivided into four arbitrary groups. Group I mice show the most precocious block in lymphoid lineage differentiation, illustrated by a low cellularity of common lymphoid progenitor cells (CLP). The thymi showed very few CD4*CD8*, double positive (DP) cells, while the CD4 CD8TCR, triple negative (TN) populations were found to be mostly constituted by the early CD44*CD25' (TNI) and few CD44*CD25* (TN2). TNl's early thymocyte progenitors (ETP) were virtually absent. At the B-cell lineage level in the bone marrow (BM) there was a major block in pre-proB differentiation. The number of peripheral T-cells was severely reduced, mainly in LN, since group I T-cells lack CCR7 expression. Group II mice presented moderate thymus atrophy. The block on TN differentiation occurs at a later stage, i.e., in the TN3 to TN4 transition, and the TNI population was characterized by a less severe depletion of the ETP. Group II mice showed a partial pre-proB block and a reduction in pre-B-cells. CLPs were also reduced but to a lesser extent than in group I mice. Group ill and group IV mice appear to have a normal thymocyte population distribution but showed an increase on ETP compartment. Group IV mice displayed thymic hyperplasia while group III mice possessed normal thymus cellularity. B-cell differentiation on both groups appeared to be normal but BM precursors had an increase in both CLP and early haematopoietic progenitor's (LSK) levels as compared with wild type mice. Cyclin Dl involvement in G1 to S transition led us to analyse in vivo division rates. Strikingly, group I mice were virtually devoid of cycling cellsin all lymphoid compartments, explaining why lymphoid lineage cells do not differentiate in these mice. In contrast, in all other groups we observed an increased BrdU incorporation. These contradicting phenotypes correlated with the expression or absence of a truncated Dl protein coded by exons 4-5. The presence of the cyclin Dl truncated mRNA was not found in group I mice but high levels of expression are consistently observed in the remaining groups. In the absence of the Dl truncated protein only trace values of Cyclins D2 and D3 were found, highlighting the role of this protein as a master D cyclin regulator, which further supports the profound aplasia and arrest in lymphoid lineage division on cells that predominantly express Cyclin D2. These results suggest that, while the function of the Dl cyclin box is redundant, the regulatory domain coded by exons 4-5 is fundamental for lymphopoiesis. Full Dl protein was also eliminated by RNA interference both in vitro and in vivo. These experiments reproduced the phenotype of group I mice. We have developed a lentiviral vector with a truncated Dl (exons 4-5) and conditional knockout (KO) mice by floxing exons 4-5 of cyclin Dl. These tools will allow us to show Cyclin Dl Cdk-independent role as a transcription regulator in lymphopoiesis and to attribute this function to exons 4-5. Understanding how exons 4-5 regulate different transcription factors might be a key in…
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012PA05T029 |
| Date | 23 November 2012 |
| Creators | Chaves Ferreira, Miguel |
| Contributors | Paris 5, Rocha, Benedita |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text, Image, StillImage, InteractiveResource |
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