Le Virus de l’Hépatite C (VHC) est un virus à ARN de polarité positive infectant plus de 130 millions de personnes dans le monde. Les inhibiteurs de Cyclophilines sont prometteurs en tant que nouvelles molécules thérapeutiques contre l'infection par le VHC. La Cyclophiline A, une protéine de l’hôte, joue un rôle essentiel pour la réplication de l’ARN viral mais sa fonction reste à élucider. La protéine non structurale du VHC NS5A (et plus particulièrement son domaine 2, NS5A-D2) est impliquée dans le mécanisme d’action de la CypA, étant donné que des mutations de résistances apparaissent dans ce domaine sous pression de sélection à la Cyclosporine A (CsA), l’inhibiteur connu de la CypA possédant une activité anti-VHC. NS5A est une protéine multifonctionnelle faiblement caractérisée au niveau moléculaire. Cette protéine est strictement requise pour la réplication de l’ARN viral mais ses fonctions moléculaires précises restent à élucider. Le domaine 2 désordonné de NS5A interagit directement avec la CypA et constitue un site substrat pour l’activité peptidyl-prolyl cis/trans isomérase de la CypA. Le site d’interaction au niveau de NS5A-D2 correspond à la région la plus conservée du domaine. Dans cette région la mutation D316E confère une résistance à la CsA. Au cours de ce travail, nous avons identifié et caractérisé par RMN un petit motif structural au sein de NS5A-D2 localisé au niveau de cette région particulière. Nous montrons que ce petit motif structural est essentiel pour la réplication de l’ARN du VHC. Nous avons également analysé les conséquences structurales des mutations de résistances aux inhibiteurs de Cyclophiline A, ainsi que les conséquences fonctionnelles de ces mutations de résistance vis-à-vis de la liaison et de l’activité PPIase de la CypA. L’alisporivir est un analogue non immunosuppresseur de la CsA actuellement en phase III de développement clinique. Nous avons analysé par cristallographie des rayons X la structure du complexe CypA-alisporivir permettant d’apporter une explication moléculaire au caractère non immunosuppresseur de cette molécule. Grâce à l’utilisation de deux stratégies de marquage de NS5A-D2 au fluor, nous avons caractérisé par RMN l’interaction moléculaire entre les protéines NS5A-D2 et NS5B, l’ARN-dépendante ARN polymérase du VHC.NS5A-D2 interagit avec l’Hexokinase 2 humaine, la première enzyme limitante de la glycolyse, cette interaction augmente l’activité enzymatique de l’HK2. Nous nous sommes intéressés aux relations structurales et fonctionnelles entre NS5A-D2 et HK2.Ces résultats apportent un nouvel éclairage sur le rôle de NS5A-D2 dans la réplication du VHC. / Hepatitis C Virus (HCV) is a positive strand RNA virus that has infected more than 130 million people worldwide. Cyclophilin inhibitors hold promise as a novel anti-HCV therapy. The host protein Cyclophilin A (CypA) plays an essential role in HCV RNA replication but its molecular function is unknown. The HCV protein NS5A (in its domain 2, NS5A-D2) has been shown to be implicated in the action of CypA as resistance mutations appeared in this domain under low doses of Cyclosporine A (CsA), the well-known CypA inhibitor with anti-HCV properties. NS5A is still an enigmatic multifunctional protein poorly characterized at the molecular level. This protein is strictly required for viral RNA replication but its precise molecular function(s) remain(s) to be elucidated. Its disordered domain 2 directly interacts with host CypA and is a substrate for the peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity of CypA. The binding site onto NS5A-D2 corresponds to the most conserved region of the domain. In this region a mutation D316E has been shown to confer CsA resistance. In this work we identified by NMR spectroscopy a short structural motif including this particular position in the otherwise disordered NS5A-D2, and report its structure. We show that this structural motif is essential for HCV RNA replication. In addition, we analyze the structural consequences of the resistance mutation to CypA inhibitors, and the functional consequences of these mutation regarding the binding and PPIase activity of CypA. Alisporivir in a non-immunosuppressive analogue of CsA with anti-HCV activity currently evaluated in phase III clinical trials, we analyzed by X-ray crystallography the structure of the CypA-Alisporivir complex in order to provide a molecular explanation for its non-immunosuppressive character. We also describe the interaction between NS5A-D2 and the HCV RNA dependent RNA polymerase NS5B. We use two different strategies to incorporate a 19F nucleus in NS5A-D2 and explore the use of 19F NMR to monitor the interaction between NS5A-D2 and NS5B. We also investigated the structural and functional relationship between NS5A-D2 and the human Hexokinase 2 (HK2), the first rate limiting enzyme of glycolysis. NS5A-D2 interacts with HK2 and this interaction is sufficient to increase HK2 activity. These results shed new light on the mechanisms by which NS5A-D2 contributes to the HCV replication cycle.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2015LIL10070 |
| Date | 25 September 2015 |
| Creators | Dujardin, Marie |
| Contributors | Lille 1, Hanoulle, Xavier |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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