La microscopie à balayage laser est limitée en résolution par la limite de diffraction de la lumière. Plusieurs méthodes de superrésolution ont été développées depuis les années 90 pour franchir cette limite. Cependant, la superrésolution est souvent obtenue au prix d'une grande complexité (laser de haute puissance pulsé, temps d'acquisition long, fluorophores spécifiques) ainsi que des limitations dans le type d'échantillon observé (observation en surface uniquement). Dans certains cas, comme pour l'illumination structurée et la microscopie SLAM, une amélioration en résolution plus modeste est obtenue, mais avec une complexité et des limites d'utilisation fortement réduites par rapport aux autres méthodes de superrésolution. Les mé- thodes que nous proposons ici sont des méthodes d'augmentation de résolution qui visent à minimiser les contraintes expérimentales et à garder un maximum des avantages des techniques d'imagerie conventionnelles. Dans les cas que nous avons étudiés, les méthodes proposées sont basées sur la microscopie confocale. Nous allons montrer dans un premier temps qu'il est possible d'augmenter de 20% la résolution d'un microscope confocal en changeant le faisceau laser utilisé pour l'excitation par un faisceau Bessel-Gauss tout en ayant un sténopé de la bonne taille (soit 1 Airy Unit). Les avantages de la méthode proposée résident dans sa simplicité d'installation et d'utilisation et sa compatibilité avec d'autres méthodes d'augmentation de résolution. Nous avons démontré les capacités d'augmentation de résolution des faisceaux Bessel-Gauss théoriquement puis exp érimentalement sur des échantillons de nano-sphères et de tissus biologiques obtenant ainsi une résolution de 0.39. Nous avons également montré que l'amélioration en résolution des faisceaux Bessel-Gauss donne une analyse statistique de la colocalisation avec un taux plus faible de faux positifs. Nous avons utilisé des faisceaux Bessel-Gauss de différents ordres pour améliorer la méthode de la microscopie SLAM et ainsi obtenir une résolution descendant à 0.17 (90 nm avec une longueur d'onde de 532 nm). La méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Dans un second temps, nous proposons une méthode permettant de bénéficier au maximum des propriétés de la déconvolution pour augmenter la résolution de la microscopie confocale. Pour cela, nous avons utilisé différents modes laser pour l'acquisition d'images et ces images sont utilisées comme données d'entrée pour la déconvolution (avec des mesures des PSF respectives). Les faisceaux laser utilisés apportent ainsi des informations complémentaires à l'algorithme de déconvolution permettant ainsi d'obtenir des images avec une résolution encore meilleure que si une simple déconvolution (utilisant le même algorithme) était utilisée sur l'image confocale. Par la suite, nous avons changé les faisceaux laser par des faisceaux Bessel-Gauss pour augmenter davantage l'ecacité de la déconvolution. Encore une fois, la méthode proposée est entièrement basée sur la microscopie confocale et seul un module permettant de changer le faisceau laser doit être ajouté au montage. Enfin, nous proposons d'aborder une méthode de reconstruction en trois dimensions par tomographie basée sur des projections obtenues en microscopie à deux photons utilisant les faisceaux Bessel-Gauss. En focalisant des faisceaux Bessel-Gauss à angle en microscopie deux photons, on obtient une série de projections utilisables pour une reconstruction tomographique. Le but est de tester la faisabilité de la méthode qui permettrait de reconstruire un volume, en nécessitant moins d'images que dans le cas d'une acquisition plan par plan, en microscopie deux photons classique. / Laser scanning microscopy is limited in lateral resolution by the diffraction of light. Superresolution methods have been developed since the 90s to overcome this limitation. However, superresolution is generally achieved at the cost of a greater complexity (high power lasers, very long acquisition times, specic uorophores) and limitations on the observable samples. In some cases, such as Structured Illumination Microscopy (SIM) and Switching Laser Modes (SLAM), a more modest improvement in resolution is obtained with a reduced complexity and fewer limitations. We propose here methods which improve the resolution while minimizing the experimental constraints and keeping most of the advantages of classical microscopy. First, we show that we can improve by twenty percent the resolution of confocal microscopy by using Bessel-Gauss beams, and by having the right pinhole size (1 Airy Unit), compared to conventional Gaussian beam based confocal microscopy. The advantages of this strategy include simplicity of installation and use, linear polarization compatibility, possibility to combine it with other resolution enhancement and superresolution strategies. We demonstrate the resolution enhancement capabilities of Bessel-Gauss beams both theoretically and experimentally on nano-spheres and biological tissue samples with a resolution of 0.39. We achieved these resolutions without any residual artifacts coming from the Bessel-Gauss beam side lobes. We also show that the resolution enhancement of Bessel-Gauss beams leads to a better statistical colocalization analysis with fewer false positive results than when using Gaussian beams. We have also used Bessel-Gauss beams of different orders to further improve the resolution by combining them in SLAM microscopy achieving a resolution of 0.17 (90 nm with a wavelength of 532 nm). In a second step, we propose a method to improve the resolution of confocal microscopy by combining different laser modes and deconvolution. Two images of the same eld are acquired with the confocal microscope using different laser modes and are used as inputs to a deconvolution algorithm. The two laser modes have different Point Spread Functions and thus provide complementary information leading to an image with enhanced resolution compared to using a single confocal image as input to the same deconvolution algorithm. By changing the laser modes to Bessel-Gauss beams, we were able to improve the effciency of the deconvolution algorithm and to obtain images with a residual Point Spread Function having a width smaller than 100 nm. The proposed method requires only a few add-ons to the classic confocal or two photon microscopes. Finally, we propose a three dimensional tomography reconstruction method using Bessel-Gauss beams as projection tools in two-photon microscopy. While focussing Bessel-Gauss beams at an angle in two photon microscopy, we can obtain a series of projections that can be used for tomography reconstruction. The aim is to test the practicality of the methods allowing to reconstruct a volume while using fewer images than plane by plane acquisitions as in classic two-photon microscopy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/34695 |
| Date | 03 May 2019 |
| Creators | Thibon, Louis |
| Contributors | De Koninck, Yves, Piché, Michel |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xxii, 155 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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