Em pacientes submetidos à diálise peritoneal (DP), alterações morfofuncionais da membrana peritoneal (MP) ocorrem de forma progressiva ao longo dos anos. Estas alterações caracterizam-se, morfologicamente, por perda da camada mesotelial, inflamação, neoangiogênese e fibrose peritoneal (FP) e, funcionalmente, pela queda na ultrafiltração. Tais alterações implicam diretamente em perda da eficiência dessa terapia renal substitutiva. Até o momento, não existe tratamento específico capaz de prevenir ou reverter esta situação. As células tronco mesenquimais (CTm) têm mostrado efeitos terapêuticos benéficos em doenças associadas à fibrose. A participação das CTm no reparo tecidual está principalmente relacionada à sua atividade parácrina, através da liberação de fatores solúveis e vesículas extracelulares (VE). As VE liberadas são importantes na intercomunicação célula-célula e possivelmente contribuem para o efeito terapêutico das CTm ao entregar seu conteúdo (mRNAs, miRNAs, proteínas) para as células alvo. Assim, o objetivo central do presente estudo foi comparar o possível efeito terapêutico das CTm de tecido adiposo (CTmTA) e de VE derivadas de CTmTA na prevenção da FP experimental em ratos. A FP foi induzida em ratos Wistar machos através de injeções intraperitoneais (IP) de gluconato de clorexidina (GC) a 0,1%, em dias alternados, por um período de 30 dias. As CTmTA utilizadas foram obtidas de tecido adiposo gonadal de rato Wistar, cultivadas e expandidas até a 4ª passagem e caracterizadas de acordo com a sua capacidade de aderência ao plástico, presença de marcadores de superfície e pela diferenciação celular in vitro. As VE derivadas de CTmTA foram isoladas por ultracentrifugação. Os protocolos de isolamento por ultracentrifugação e caracterização por microscopia eletrônica, rastreamento de nanopartículas e quantificação das proteínas totais das VE foram padronizados e estabelecidos no laboratório. Os tratamentos com 2x106 CTmTA ou com 30 ug VE foram administrados por injeções de IP. Os animais do estudo foram divididos em 4 grupos: Grupo Controle (n = 8), animais que receberam apenas injeções IP de solução fisiológica; Grupo FP (n = 9), animais que receberam injeções IP de GC para indução da FP e foram tratados com solução fisiológica; Grupo FP + CTmTA (n = 8), animais que receberam injeções IP de GC para indução da PF e foram tratados com 2x106 CTmTA, no 3º e 10º dias, via IP, e Grupo FP + VE (n = 8), animais que receberam injeções IP de GC para indução da FP e foram tratados com 30 ug de VE, IP no 3º e 10º dias, via IP. Após 30 dias da indução de FP, os animais foram submetidos ao teste de função peritoneal e, em seguida, à eutanásia para coleta de amostras de tecido do peritôneo. As amostras do peritôneo parietal foram direcionadas para análises histológicas, imunohistoquímicas, de imunofluorescência e biologia molecular. No Grupo FP, como esperado, houve um aumento significativo da espessura da MP. Os tratamentos com CTmTA e VE preveniram o espessamento da MP, mantendo a espessura similar à do Grupo Controle. Os tratamentos com CTmTA e VE bloquearam o aumento do número de miofibroblastos, da expressão de fibronectina e de fatores envolvidos na FP (TGF-beta e FSP-1), observados nos animais do Grupo FP. Além disso, a expressão gênica de Smad3, que está associada à ativação de genes pró-fibróticos, estava aumentada no Grupo FP e foi reduzida nos grupos tratados. Por outro lado, a expressão gênica de Smad7, um gene associado à contrarregulação do TGF-beta, estava reduzida no Grupo FP e foi aumentada nos grupos que receberam tratamento. Os tratamentos com CTmTA e VE também apresentaram efeitos anti-inflamatórios, reduzindo o número de macrófagos e de linfócitos na MP e diminuindo a expressão do TNF-alfa, uma citocina pró-inflamatória, quando comparados ao Grupo FP. Com relação a análise funcional, o grupo tratado com VE apresentou melhora na capacidade de ultrafiltração. No entanto, os tratamentos com CTmTA e VE não alteraram o transporte de glicose pela MP em relação ao Grupo FP. Outro aspecto dos efeitos dos tratamentos CTmTA e VE diz respeito à neoangiogênese na MP, importante fator relacionado a capacidade de ultrafiltração. Apesar dos grupos tratados com CTmTA e VE apresentarem diminuição significativa da expressão de VEGF na MP, não foi constatada diferença na densidade capilar na MP destes grupos, em relação ao Grupo FP. Em conclusão, no modelo experimental de FP, os tratamentos com CTmTA e VE apresentaram efeito anti-inflamatório e foram igualmente eficientes no bloqueio do processo de FP. O tratamento com VE mostrou melhor capacidade de preservação da função peritoneal, com aumento da capacidade de ultrafiltração. Portanto, os tratamentos com CTmTA ou com VE derivadas de CTmTA apresentam potencial terapêutico e constituem uma nova abordagem, ainda pouco explorada, na prevenção do desenvolvimento da FP associada à DP / In patients undergoing peritoneal dialysis (PD), morphofunctional changes of the peritoneal membrane (PM) occur progressively over the years. These modifications are morphologically characterized by loss of the mesothelial layer, inflammation, neoangiogenesis and peritoneal fibrosis (PF), and functionally, by the reduction in ultrafiltration (UF). Moreover, these changes directly imply in failure of treatment. Currently, there is no clinical alternative to prevent or reverse this situation. In this context, mesenchymal stem cells (MSC) have shown beneficial therapeutic effects in diseases associated with fibrosis. The participation of MSC in tissue repair is related to their paracrine activity, through the release of soluble factors and extracellular vesicles (EV). The EV released are important to cell-to-cell communication and the possibility to contribute to the therapeutic effect of MSC, by delivering their content (mRNAs, miRNAs, proteins) to the target cells. Therefore, the aim of this study was to compare the possible therapeutic effect of MSC versus EV derived from MSC for prevention of experimental PF fibrosis in rats. PF was induced in male Wistar rats by intraperitoneal (IP) injections of 0.1% chlorhexidine gluconate (CG) on alternate days, for a period of 30 days. The MSC used were obtained from Wistar rats gonadal adipose tissue (ASC), cultured and expanded to the 4th passage and characterized according to their ability to adhere to plastic, presence of membranes markers and by cell differentiation in vitro. EV derived from ASC were isolated by ultracentrifugation. The protocols of ultracentrifugation and characterization by electron microscopy, nanoparticle tracking and quantification of total proteins from EV were standardized and established in the laboratory. Both treatments using ASC (2x106 cells) or EV (30 ug) were administered via IP injections. The animals were divided into four groups: Control group (n = 8), animals that received only IP injections of physiological solution; PF group (n = 9), animals that received IP injections of CG to induce PF and were treated with physiological solution; PF+ASC group (n = 8), animals that received IP injections of CG for induction of PF and were treated with 2x106 ASC, at the 3rd and 10th day, by IP delivery; PF+EV group (n = 8), animals that received IP injections of CG for induction of PF and were treated with 30 ug of EV at the 3rd and 10th day, by IP delivery. After 30 days of PF induction, the animals were submitted to the peritoneal function test and then, to euthanasia to collect tissue samples from the peritoneum. The samples were analyzed by histology immunohistochemistry, immunofluorescence, and also by molecular biology. In the FP group, there was a significant increase in the thickness of the PM. Both treatments with ASC or EV prevented increase in PM thickness. Importantly, ASC and EV treatments blocked the increased number of myofibroblast, fibronectin expression and the factors involved in PF (TGF-beta and FSP-1) observed in the PF group. In addition, the Smad3 gene expression, which is associated with activation of pro-fibrotic genes, was increased in the PF group and decreased in the treatments groups. Conversely, the gene expression of Smad7, a gene associated with TGF-beta against regulation, was decreased in the PF group and increased in the animals that received the treatment. ASC and EV injections also showed anti-inflammatory effects, reducing the infiltration of macrophages and lymphocytes into the PM and decreasing the expression of TNF-alpha, a proinflammatory cytokine. The treatments with ASC and EV did not alter the glucose transport by the PM in relation to the PF group, but promoting an increase of the UF capacity. Only the EV treated group showed an increase in UF capacity. Another aspect of the effects of ASC and EV treatments concerns to neoangiogenesis in the PM, an important factor related to the UF capacity. Although the treated groups showed a significant decrease of the VEGF expression in the PM, no difference in the capillary density was observed in relation of PF group. In conclusion, in the experimental model of FP, treatement with ASC or EV showed anti- inflammatory effects and were equally efficient in blocking the PF process. However, the treatment with EV showed a better capacity of preservation of the peritoneal function, with increased capacity of UF. Therefore, the use of ASC and EV potentially represents a new therapeutic approach in preventing the development of PF associated with PD
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23102018-105329 |
| Date | 24 July 2018 |
| Creators | Gouveia, Priscila Queiroz |
| Contributors | Noronha, Irene de Lourdes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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