Recentemente, uma molécula baseada em nucleotídeos, a adenosina monofosfato dimérica cíclica (c-di-AMP), foi identificada em várias bactérias patogênicas, ganhando rapidamente o status de um sinalizador central no controle de diversos processos bacterianos essenciais, tais como transporte iônico e vigilância a danos no DNA. Em Staphylococcus aureus, por exemplo, o c-di-AMP é essencial para homeostase da parede celular e resistência aos estresses ambientais. A biossíntese de c-di-AMP envolve a condensação de duas moléculas de ATP, catalisadas por enzimas que contenham o domínio DAC (diadenilato ciclase). Especialmente em S. aureus, somente uma ciclase (DacA) é responsável pela síntese desse segundo-mensageiro, através da enzima DacA. Recentemente, nosso grupo determinou a estrutura da DacA de S. aureus, demonstrando a importância do seu estado oligomérico para o mecanismo catalítico. Diferentemente da primeira diadenilato caracterizada, a DisA, uma enzima octamérica, a atividade enzimática da DacA ocorre através do encontro de dois dímeros distintos, formando uma interface cataliticamente competente. Dadas essas características, o foco desse trabalho foi a busca de novos inibidores para a DacA, através de triagens em larga escala (HTS), triagem cristalográfica por fragmentos e docagem molecular. Foram encontrados 30 compostos com atividade inibitória nos ensaios de HTS, 15 compostos derivados de fragmentos da triagem cristalográfica e construída uma biblioteca de 480 compostos docados virtualmente no sítio ativo. Os compostos encontrados na triagem cristalográfica foram caracterizados com respeito ao seu valor de IC50 frente à atividade enzimática. O composto AN-584/43409544 se demonstrou bastante promissor, com valor de IC50 de 54 µM. Ainda, um análogo desse composto foi encontrado na interface dimérica da DacA nos estudos cristalográficos, o que mostra um possível sítio alostérico para o desenvolvimento e busca de inibidores. Os resultados gerados nesse projeto podem servir de base para estudos futuros e desenvolvimento de novos antibióticos, que em combinação com os tratamentos atualmente disponíveis pode levar ao controle das infecções até mesmo das formas mais resistentes de S. aureus. / Recently, a nucleotide-based molecule, the cyclic dimeric adenosine monophosphate (c-di-AMP), has been identified in several pathogenic bacteria, rapidly gaining the status of a central signaling controlling several essential bacterial processes, such as ion transport and DNA damage surveillance. In Staphylococcus aureus, for example, c-di-AMP is essential for homeostasis of the cell wall and resistance to environmental stresses. The biosynthesis of c-di-AMP involves the condensation of two molecules of ATP, catalyzed by enzymes that contain the DAC (diadenylate cyclase) domain. Especially in S. aureus, only one cyclase (DacA) is responsible for the synthesis of this second-messenger. Recently, our group determined the structure of the S. aureus diadenylate cyclase, demonstrating the importance of their oligomeric state for the catalytic mechanism. Unlike DisA, a octameric diadenylate cyclase, the enzymatic activity of DacA occurs through the meeting of two dimers forming a catalytically competent interface. Given these characteristics, the focus of this work was the search for new inhibitors through high-throughput screening (HTS), crystallographic screening of fragments and molecular docking. It was found 30 compounds with inhibitory activity in HTS assays, 15 compounds derived from fragments of crystallographic screening and built a 480 compound library virtually docked in the active site. The compounds found in the crystallographic screening were characterized with respect to its IC50 value. The compound AN-584/43409544 has been shown verry promising, with IC50 of 54 µM. Also, an analog of this compound was found in the dimeric interface of DacA in crystallographic assays, which shows a possible allosteric site for inhibitors search and development. The results generated in this project can serve as a basis for future studies and development of new antibiotics, which in combination with the currently available treatments can lead to infection control even of the most resistant strains of S. aureus.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-14102016-103118 |
| Date | 01 June 2016 |
| Creators | Meneghello, Raphael |
| Contributors | Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque Salles |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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