O Diabetes Mellitus tipo I (DM1) é causado pela destruição auto-imune das células β pancreáticas, encontradas na porção endócrina do pâncreas, constituída pelas ilhotas pancreáticas. As células β são responsáveis pela produção e liberação de insulina, um hormônio que promove a internalização da glicose pelas células. Junto com outros hormônios, a insulina é um dos principais reguladores do nível de glicose sanguinea (glicemia). Uma das terapias utilizadas para o tratamento do DM1 é o transplante de ilhotas pancreáticas. Entretanto, um dos maiores problemas em relação a esta terapia é a falta de massa celular adequada para ser infundida no paciente. Uma tentativa para solucionar este problema, é o desenvolvimento de fontes alternativas de células produtoras de insulina, como as células-tronco, que possuem a capacidade de se diferenciarem em diversos tipos de células, inclusive nas produtoras de insulina. Pax4 é um dos fatores de transcrição responsáveis pela diferenciação de células β , sendo essencial para o apropriado desenvolvimento e maturação destas, constitui um bom candidato para induzir a diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina in vitro. Para introduzir o Pax4 nas células-tronco, sem provocar alterações no genoma das células diferenciadas, em virtude dos potenciais efeitos indesejáveis de vetores que se integram ao genoma celular, recorreu-se às proteínas contendo domínio de transdução (PTDs), que são capazes de carregar a proteína Pax4, através da membrana, diretamente para o interior das células. As PTDs são pequenas sequências peptídicas que permitem a translocação de proteínas através de membranas celulares e sua internalização em células-alvo. Uma das PTDs mais comumente estudadas é a VP22, produto do gene UL49 do Herpes Simplex vírus tipo I. Portanto, a proteína de fusão VP22.Pax4 permitiria que o Pax4 fosse inserido em células-tronco, possibilitando que este fator de transcrição ative a transcrição de certos genes que aumentariam a eficiência de diferenciação das células-tronco em células produtoras de insulina. Para tal, amplificamos e clonamos o cDNA do Pax4 a partir do RNA das células RINm5f de insulinoma murino, construímos o vetor pVP22.Pax4, o qual foi transfectado em células CHO, que passaram a produzir a proteína de fusão VP22.Pax4. Após o tratamento de células-tronco com a proteína de fusão VP22.eGFP e análise por microscopia confocal, comprovamos que a VP22 é capaz de tranduzir a proteína de fusão também neste tipo celular. Portanto, incorporamos a um dos passos do protocolo de diferenciação de células-tronco em células produtoras de insulina, utilizado em nosso laboratório, a co-cultura com células CHO produtoras de VP22.Pax4. Observamos que a introdução do Pax4 leva a formação de um número maior de agregados celulares (clusters) produtores de insulina. Concluímos, então, que a utilização da VP22 como ferramenta para internalização de proteínas em células-tronco é viável e que a adição do Pax4 pode trazer melhorias para protocolos que busquem a produção de células produtoras de insulina. / Diabetes Mellitus type 1 (DM1) is caused by an auto-imunne destruction of the pancreatic β cells, found in the endocrine portion of the pancreas, known as pancreatic islets. These β cells are responsible production and release of insulin, a hormone which promotes glucose internalization by cells. Along with other hormones, insulin is a major regulator of blood glucose levels (glycemia). One of the therapeutical strategies used to treat DM1 is pancreatic islet transplantation. One of the major problem related to this therapy is the lack of adequate cell mass to be infused into the pacients. An attempt to solve this problem is the development of an alternative source of insulin-producing cells by differentiation of stem cells, which display this differentiating potential. Pax4 is one of the transcription factors responsibles for β cell differentiation, being essential for its proper development and maturation, therefore being a good candidate to induce stem cell differentiation into insulin producing cells in vitro. A promising alternative to avoid the alterations of the differentiated cells genome due to its undesirable effects of integrating vectors, but yet allowing the Pax4 to act in diferentiation within the cells are the proteins with a transduction domain (PTDs), which would have the ability to lead the Pax4 protein directly into the cells. The Pax4 could thus act in the nucleus and generate specific transcriptional responses. The PTDs are small peptide sequences which allow translocation of proteins across cell membranes and their internalization into target cells. One of the most commonly studied PTDs is the VP22, a product of the UL49 gene from Herpes Simplex vírus type I. Therefore, the VP22.Pax4 fusion protein would transduce Pax4 into the stem cells, thus allowing the transcription activation of certain genes by Pax4, leading to improvement in the process of stem cells differentiation into insulin-producing cells. To this end, we cloned the Pax4 cDNA from RINm5f murine insulinoma cells, constructed the pVP22.Pax4 vector and transfected this construct into CHO cells, which then produced the VP22.Pax4 fusion protein. Upon verifying that VP22 was also able to transduce proteins into stem cells, by confocal microscopy analysis, after the treatment of these cells with the fusion protein VP22.eGFP, we incorporated the fusion protein VP22.Pax4 to one of the steps of the protocol used for stem cells diferentiation into insulin producing cells in our lab, by co-culturing with CHO cells producing VP22.Pax4. We observed that the addition of Pax4 led to the formation of a higher number of insulin producing cell clusters, therefore we conclude that VP22 may be used as a tool to internalize proteins into stem cells, and that the addition of Pax4 may improves protocols seeking the production of insulin-producing cell
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01032011-141401 |
| Date | 12 November 2010 |
| Creators | Gabanyi, Ilana |
| Contributors | Sogayar, Mari Cleide |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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