Dans ce projet de thèse, une variété de techniques a été employée pour étudier l’alpha-L-arabinofuranosidase de Thermobacillus xylanilyticus (TxAbf), notamment en ce qui concerne les relations structure/fonctions et son activité de transglycosylation. Nos travaux ont eu pour objectif d’apporter un éclairage quant au rôle de la dynamique dans l’activité catalytique de la TxAbf, en se focalisant sur le mouvement de la boucle bêta2alpha2, et d’explorer la spécificité du sous-site [+1], un élément du site actif qui est particulièrement pertinent pour l’activité de transglycosylation. Enfin, nous avons entrepris des travaux d’ingénierie visant la création de transarabinofuranosylases performantes. Nos résultats confirment le rôle important de la boucle bêta2alpha2 et suggèrent que le mouvement de celle-ci permet de relocaliser les résidus His98 et Trp99 de manière à créer un site actif opérationnel. Le résidu Trp99 apparaît comme un élément clé du sous-site [-1] de la TxAbf, alors que le résidu His98, qui n’est pas conservé dans l’ensemble des enzymes de la famille GH51, participerait à la formation d’un sous-site [+2’]. Concernant le sous-site [+1], nos résultats confirment la large spécificité celui-ci et montrent clairement que l’encombrement stérique à la position C-5 des glycosides accepteurs est défavorable à la réaction de transglycosylation. Par ailleurs, nous avons pu réaliser pour la première fois la synthèse de trisaccharides, utilisant comme accepteur l’alpha-D-xylobioside de benzyle et comme donneur le β-D-galactofuranoside de para-nitrophényle. Enfin, nos travaux de mutagenèse aléatoire et le criblage de banques a permis d’identifier deux mutations Phe26Leu et Trp178Arg, qui se situent au niveau des sous-sites [-1] et [+1], respectivement. Selon nos premières analyses, les mutants correspondants rendraient moins favorable la déglycosylation de l’intermédiaire glycosyl-enzyme par une molécule d’eau, réduisant ainsi l'hydrolyse secondaire et stabilisant par la même occasion le produit de synthèse. En employant une deuxième méthode de criblage plus sophistiquée, impliquant l’utilisation d’accepteurs xylo-oligosaccharidiques, nous avons pu obtenir des enzymes mutées qui (i) catalysent des réactions de transglycosylation en présence de xylobiose (l’enzyme sauvage ne catalysant que très faiblement cette réaction) (ii) se caractérisent par une absence quasi-totale d’hydrolyse secondaire et (iii) comportent des mutations situées à différentes positions (e.g. au niveau des sous-sites [-1], [+1] et [+2’]) et qui semblent moduler le ratio Transglycosylation/Hydrolyse en faveur de la synthèse / In this investigation, a variety of techniques to study the Thermobacillus xylanilyticus alpha-L-arabinofuranosidase (TxAbf) have been employed, especially with regard to structure-functions relations and the enzyme’s ability to catalyze transglycosylation reactions. The aim of our work was to better understand the dynamic role of the bêta2alpha2 loop and to explore the substrate specificity of the subsite [+1], an important active site element with respect to transglycosylation. Finally, this work has focused on the creation of new transarabinofuranosylases using random engineering and screening approaches.Our results confirm the important role of the bêta2alpha2 loop and suggest that its movement during catalysis relocalizes residues His98 and Trp99 and thus permits the formation of a catalytically-viable active site configuration. Trp99 is relocalized from a solvent exposed position into a buried position and forms a critical element of subsite [-1], whereas His98, a residue that is not conserved in all GH51 members, appears to form a part of subsite [+2’]. Regarding subsite [+1], our results confirm its wide specificity and indicate that steric bulkiness at the C-5 position of glycoside acceptors leads to reduced transglycosylation. In this work, we have also demonstrated for the first time the synthesis by TxAbf of trisaccharides, using benzyl alpha-D-xylobioside as the acceptor and para-nitrophenyl β-D-galactofuranoside as the donor. Finally, random mutagenesis and screening has led to the identification of two mutations Phe26Leu and Trp178Arg, which are located in sub-sites [-1] and [+1] respectively, that appear to reduce the water-mediated deglycosylation of the glycosyl-enzyme intermediate. Consequently, the corresponding mutants reduce secondary hydrolysis and favourably affect the operational stability of synthetic products. Using a second more sophisticated screening method that involves the use of xylo-oligosaccharide acceptors, it has been possible to isolate mutant enzymes that (i) catalyze transglycosylation reactions in the presence of xylobioside (a reaction that is poorly catalyzed by wild type TxAbf), (ii) show almost no secondary hydrolysis, (iii) display point mutations at several key locations (e.g. in sub-sites [-1], [+1] and [+2’]) that seem to modulate the Transglycosylation/Hydrolysis ratio in favour of synthesis
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012ISAT0053 |
| Date | 23 October 2012 |
| Creators | Arab-Jaziri, Faten |
| Contributors | Toulouse, INSA, O'Donohue, Michael, Fauré, Régis |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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