The netrin-1 receptor Deleted in Colorectal Cancer (DCC) acts as a tyrosine kinase-associated receptor to mediate the attractive response of the growth cone towards the source of netrin-1. Fyn phosphorylates DCC on tyrosine 1418 to trigger neurite formation. DCC function requires lipid rafts, but it is not known how lipid rafts regulate DCC signaling. The activity of the Rho family GTPases Rac1 and Cdc42 are required to mediate DCC-dependent neurite formation. Determining how lipid rafts regulate DCC signaling and where Rac1 and Cdc42 activity is in a cell relative to DCC would aid in understanding the complex mechanism by which DCC connects netrin-1 binding to polarized cytoskeletal remodeling and axon growth to guide the growth cone towards the netrin-1 source. In the first part of this thesis, we have demonstrated that while netrin-1 binds to DCC in lipid rafts at the cell surface, DCC targeting to lipid rafts is insensitive to netrin-1 addition. DCC is phosphorylated both in rafts and non-lipid rafts and its association with Fyn and activation of FAK are all detected outside of lipid rafts. Thus, we show that while netrin-1 binds to DCC in lipid rafts, subsequent signals are propagated outside of this compartment independently of DCC translocation out of lipid rafts. In the second part, we developed a methodology and analysis regimen to image active Rac1 and Cdc42 by using sensitized emission fluorescence resonance energy transfer (FRET) in living cells and compared the utility of using intermolecular versus intramolecular FRET-based biosensors in visualizing Rho GTPase activity. In the last part we combined the FRET-biosensors with DCC in optimal imaging environment of Hela cells and determined that DCC localized to an F-actin enriched compartment on the cell surface, along with Rac1 and Cdc42, that did not correspond to early, late, or recycling endosomes. ICY-Cdc42 revealed that DCC colocalized with active Cdc42 and induced a gradient of Cdc42 activity, wh / Le récepteur transmembranaire Deleted in Colorectal Cancer (DCC) agit comme un récepteur à activité tyrosine kinase pour arbitrer l'attraction du cône de croissance vers une source de protéines chémotropiques, les nétrines. Fyn phosphoryle DCC sur le résidu tyrosine en position 1418 et cette action est nécessaire pour déclencher la formation de neurites. Les domaines membranaires appelés « lipid rafts » sont requis pour la fonction de DCC mais la façon dont ces « rafts » régulent la signalisation de DCC est jusqu'à ce jour inconnue. L'activité des GTPases Rho, en particulier celles de Rac1 et Cdc42, est cruciale pour la croissance de neurites induite par DCC. Démontrer la manière dont les rafts régulent la signalisation de DCC ainsi que positionner les activités de Rac1 et Cdc42 dans la cellule par rapport à DCC pourrait aider à comprendre le mécanisme complexe par lequel la nétrine-1 agit via DCC afin de provoquer la réorganisation du cytoskelette et la croissance axonale qui permet de guider le cône de croissance vers une source de nétrine-1. Dans la première partie de cette thèse, nous avons démontré que la nétrine-1 se lie à DCC à la surface cellulaire dans les rafts mais que la relocalisation de DCC dans ces domaines membranaires était insensible à l'ajout additionnel de nétrine-1. La phosphorylation de DCC survient aussi bien à l'intérieur ou à l'extérieur des rafts mais son association avec Fyn et l'activation de Fak sont des événements qui ont été seulement observés à l'extérieur des rafts. Par conséquent, nous montrons que lorsque la nétrine-1 se lie à DCC dans les rafts, des signaux subséquents se propagent à l'extérieur de ces domaines, indépendamment de la translocation de DCC à l'extérieur de ces derniers. Dans la deuxième partie, nous avons développé une méthodologie et une façon analytique servant à imager les activités de Rac1 et Cdc42 dans les cellules vivantes en utilisant la te
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.18667 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Petrie, Ryan John |
| Contributors | Nathalie Lamarche (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Anatomy and Cell Biology) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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