Ubiquitin is a 76 amino acid long polypeptide, which is present throughout eukaryotes in a highly conserved fashion. Ubiquitin can modify proteins by becoming covalently attached to them. Eukaryotic cells employ ubiquitin to maintain and regulate fundamental cellular processes like protein degradation, the immune response and transcriptional and translational regulation. Transfer of ubiquitin to the substrate is achieved by the catalysis of three classes of enzymes namely E1, E2 and E3. Together these enzymes form a pyramidal hierarchy, where E1 stands at the apex and E3 enzymes form the base of the pathway.
The ubiquitin activating enzyme 1 (UBA1) plays a major role in ubiquitylation being the ubiquitin-dedicated E1 enzyme. In addition, it is the only enzyme in this pathway to use ATP as an energy source to catalyze two important reactions. The products of these reactions, ubiquitin adenylate and ubiquitin thioester, are the essential intermediate states of ubiquitin, for being conjugated to the target protein. With the help of X-ray crystallography and biochemical approaches, snapshots of multiple catalytic states of UBA1, where it is bound to Mg-ATP, ubiquitin and the E2 Ubc13 as substrates could be captured. With the help of these high-resolution crystal structures, deeper insights into the enzymatic mechanism of UBA1 could be attained. The resulting insights into the catalytic cycle were further validated by biochemical assays. It could be shown that ATP acts as a molecular switch to induce the enzyme’s open conformation. Ubiquitin-binding to the enzyme leads to domain rotations, which facilitate the recruitment of a cognate E2 enzyme. The interdomain communication as well as the cross-talk with the substrates and the products fuel the enzymatic cycle of UBA1.
Due to the proven efficacy of proteasome inhibitors for cancer treatment, which block degradation of proteins labeled with ubiquitin, enzymes participating in the ubiquitylation cascade have been targeted by researchers for the development of novel anti-cancer therapeutics. UBA1 inhibition has been shown to preferentially induce cell death in malignant cells, and it can also be used as a strategy to overcome resistance against proteasome inhibitors. MLN7243, an adenosyl sulfamate inhibitor developed by Millenium Pharmaceutical to specifically target UBA1, is currently in Phase-I clinical trials for the treatment of solid tumors. UBA1 could be crystallized in complex with three adenosyl sulfamate inhibitors covalently linked to ubiquitin, which are promising drug candidates for cancer therapy. The inhibitors employed, MLN7243, MLN4924 and ABPA3, show distinct specificities towards different E1 enzymes. With the help of crystal structures the specificity determinants of these inhibitors could be deciphered, which were further confirmed by inhibition assays as well as molecular dynamics simulations. Together these crystal structures provide a starting point for developing E1-specific inhibitors, which, besides their potential for medicinal purposes, are important tools to better understand the function of the ubiquitin system as well as the action of ubiquitin-like proteins. / Ubiquitin ist ein 76 Aminosäuren langes Polypeptid, das in allen Eukaryoten vorkommt und hoch konserviert ist. Ubiquitin kann Proteine modifizieren indem es mittels einer kovalente Bindung an diese angeheftet wird. Eukaryotische Zellen nutzen Ubiquitin, um fundamentale zelluläre Prozesse wie den Proteinabbau, die Immunantwort sowie die Regulation der Transkription und Translation aufrecht zu erhalten. Der Transfer von Ubiquitin auf das Substrat wird durch die Katalyse von drei Enzymklassen E1, E2 und E3 erreicht. Zusammen bilden diese Enzyme eine pyramidale Hierarchie in der das E1 an der Spitze steht und die E3 Enzyme die Basis bilden.
Das Ubiquitin-aktivierende Enzym 1 (UBA1) ist das E1 Enzym für Ubiquitin und spielt somit eine Hauptrolle in der Ubiquitinierung. Weiterhin ist es das einzige Enzym dieses Stoffwechselweges, das ATP als Energie nutzt, um zwei wichtige Reaktionen zu katalysieren. Die Produkte dieser Reaktionen, Ubiquitin-Adenylat und thioesterifiziertes Ubiquitin, sind die essentiellen Ubiquitinintermediate für die Konjugation an das Zielprotein. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse und biochemischer Ansätze konnten für UBA1 Momentaufnahmen multipler katalytischer Zustände erfasst werden, in denen es an die Substrate Mg-ATP, Ubiquitin und dem E2 Enzym Ubc13 gebunden vorliegt. Mit Hilfe dieser hochaufgelösten Kristallstrukturen konnten tiefere Einblicke in den enzymatischen Mechanismus des Enzyms erzielt werden. Die gesammelten Erkenntnisse zum katalytischen Zyklus wurden mittels biochemischer Methoden validiert. Es konnte gezeigt werden, dass ATP als molekularer Schalter fungiert, um das Enzym in seine offene Konformation zu überführen. Die Bindung von Bindung an das Enzym führt zur Rotation einzelner Domänen welche die Rekrutierung des E2 Enzymes erleichtern. Die Interdomänen-Interaktion sowie molekulare Wechselwirkungen mit den Substraten und Produkten treiben den enzymatischen Zyklus von UBA1 an.
Die Einsatz von Proteasominhibitoren, die den Abbau von Ubiquitin-markierten Proteinen blockieren, in der Krebstherapie weckte das Interesse von Forschern Enzyme, die an der Ubiquitinierungs-Kaskade beteiligt sind, als neue therapeutische Ziele zur Bekämpfung von Krebserkrankungen zu erschließen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung von UBA1 bevorzugt den Tod maligner Zellen induziert und als Strategie für die Überwindung der Resistenz von Proteasominhibitoren genutzt werden kann. MLN7243, ein Adenosyl-Sulfamat Inhibitor, der von Millenium Pharmaceuticals entwickelt wurde und spezifisch UBA1 angreift, befindet sich gegenwärtig in klinischen Studien der Phase I mit dem Ziel einer Behandlung von soliden Tumoren. UBA1 konnte im Komplex mit drei an Ubiquitin gekoppelten Adenosyl-Sulfamat Inhibitoren, die vielversprechende Wirkstoffe in der Krebstherapie
sind, kristallisiert werden. Die Inhibitoren MLN7243, MLN4924 und ABPA3 besitzen unterschiedliche Spezifitäten für verschiedene E1 Enzyme. Mit Hilfe von Kristallstrukturen konnten Spezifitätsfaktoren dieser Inhibitoren entschlüsselt werden, die im Weiteren mittels Inhibierungstests und molekulardynamischer Simulationen bestätigt werden konnten. Diese Kristallstrukturen lieferten ein klareres Bild für die Entwicklung E1-spezifischer Inhibitoren mit deren Hilfe, neben ihrer potentiellen medizinischen Anwendung, ein besseres Verständnis des Ubiquitinsystems und Ubiquitin-ähnlicher kovalenter Verknüpfungen gewonnen werden kann.
Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:16722 |
Date | January 2020 |
Creators | Misra, Mohit |
Source Sets | University of Würzburg |
Language | English |
Detected Language | German |
Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
Format | application/pdf |
Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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