Slutsteget i immunförsvarets komplementaktivering innefattar en klyvning av komplementprotein C5, till C5a och C5b, vilket initierar bildandet av terminalt komplementkomplex (TCC) som i form av membran-attack-komplex (MAC) bildar cytotoxiska porer i bland annat gramnegativa bakterier. Bildandet av MAC kan blockeras av endogena regulatorer och TCC frisätts då som ett lösligt komplex, sC5b-9, i plasma. I examensarbetet studerades en variant av TCC, som i tidigare studier visats bildas oberoende av C3- och C5-konvertas när serum surgjorts till pH < 7,0 in vitro. Syftet med studien var att studera om detta atypiska TCC (aTCC) bildades hos grisar, som i en mekonium aspirationssyndrom (MAS)-modell, erhållit ett sänkt systemiskt pH in vivo. I syftet ingick också att etablera en ELISA-baserad metod för att analysera aTCC. I en sandwich ELISA användes monoklonal anti-C5a/C5a (desArg) (klon T13/9) som fångande antikropp och monoklonal anti-C9 (klon aE11) som detekterande antikropp för att analysera aTCC i plasmaprover från 18 MAS-grisar, samt i ett kontrollmaterial bestående av grisserum som surgjorts till pH 6,8 och 6,4 in vitro. Mängden aTCC i kontrollproverna ökade när pH sänktes men innehållet av aTCC i plasmaproverna minskade över MAS-studiens förlopp. När den relativa förändringen i aTCC relaterades till MAS-grisarnas slutliga pH kunde ett signifikant samband ses (p = 0,02) som visade att en större förändring i aTCC sammanföll med ett lägre slutligt pH. Nivåerna av aTCC var generellt sett högre i plasmaproverna jämfört med kontrollproverna vilket skulle kunnat bero på skillnader i plasma vs serum avseende aTCC eller att proverna kom från grisar med olika ålder och vikt. Avsaknad av grisspecifik standard och negativ kontroll samt lågt signal/brusförhållande bidrar till felkällor för analysen och denna kräver fortsatt optimering. / The late steps of complement activation involves a cleavage of complement protein C5, to C5a and C5b, which initiates the formation of terminal complement complex (TCC). The final complex is referred to as the membrane-attack-complex (MAC) which forms cytotoxic pores in, inter alia, gram-negative bacteria. The formation of MAC can be inhibited by endogenous regulators and the TCC is then released as a soluble complex, sC5b-9, in plasma. In the degree project, another type of TCC was studied, which in previous studies had shown to form independently of C3 and C5 convertases when serum was acidified to pH <7.0 in vitro. The purpose of the study was to investigate whether this atypical TCC (aTCC) was formed in piglets, which in a model of meconium aspiration syndrome (MAS), received a reduced systemic pH in vivo. The purpose was also to establish an ELISA for analyzing aTCC. Sandwich ELISA, with monoclonal anti-C5a / C5a (desArg) (clone T13/9) as a capture antibody and monoclonal anti-C9 (clone aE11) as a detection antibody, was used to analyse aTCC in plasma samples from 18 MAS piglets, and in control samples consisting of pig serum acidified to pH 6.8 and 6.4 in vitro. The amount of aTCC in the control samples increased when the pH was lowered, but the content of aTCC in the plasma samples decreased over the course of the MAS study. When the relative change in aTCC was related to the final pH of the MAS pigs, a significant relationship could be seen (p = 0.02) which showed that a major change in the aTCC coincided with a lower final pH. aTCC were generally higher in plasma samples compared with control samples, which could be due to differences in plasma vs serum for aTCC or that the samples came from pigs of different age and weight. Lack of pig-specific standard and negative control as well as low signal to noise ratio contribute to sources of error for the analysis and this requires continued optimization.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:lnu-78509 |
| Date | January 2018 |
| Creators | Classon, Lisa |
| Publisher | Linnéuniversitetet, Institutionen för kemi och biomedicin (KOB) |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Swedish |
| Detected Language | English |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0017 seconds