Aquest
treball
està
centrat
en
l’estudi
de
la
producció
de
proteïnes
recombinants
en
cultius
semi-‐continus
d’alta
densitat
cel·∙lular
utilitzant
E.coli.
Particularment,
l’objectiu
és
el
desenvolupament
d’un
model
que
sigui
capaç
de
predir
l’evolució
amb
el
temps
de
la
producció
de
l’Aldolasa
Ramnulosa-‐1-‐Fosfat
(RhuA).
Primer,
s’ha
dut
a
terme
un
estudi
a
nivell
qualitatiu
i
quantitatiu
de
les
variables
que
juguen
un
paper
fonamental
en
la
producció
de
proteïna.
Aquest
estudi
ha
permès
l’avaluació
de
l’impacte
en
la
producció
de
proteïna
(tant
en
unitats
de
massa
com
activitat)
de
les
principals
variables
experimentals
(la
concentració
d’inductor
i
biomassa
en
el
moment
d’inducció
i
la
velocitat
específica
de
creixement).
La
Metodologia
de
Superfície
de
Resposta
(MSR)
permet
la
determinació
de
les
condicions
òptimes
de
cultiu
per
tal
de
maximitzar
la
producció,
a
la
vegada
que
permet
la
determinació
de
les
condicions
de
treball
més
adequades.
Segon,
s’ha
desenvolupat,
calibrat
i
validat
un
model
de
transport
d’IPTG
des
del
medi
de
cultiu
a
l’interior
cel·∙lular.
Aquest
model
aportarà
un
estudi
més
profund
del
sistema
d’inducció.
Està
dividit
en
dues
etapes:
a)
amb
la
utilització
d’una
soca
deficient
en
lactosa
permeases
(les
proteïnes
responsables
del
transport
específic
de
lactosa
-‐i
IPTG)
s’han
pogut
determinar
els
mecanismes
de
transport
no
específics;
b)
la
contribució
al
transport
de
les
proteïnes
específiques
s’ha
afegit
als
mecanismes
no
específics.
S’ha
demostrat
que
el
model
és
capaç
de
predir,
no
només
l’evolució
de
la
concentració
d’inductor
per
a
la
soca
model,
sinó
que
ho
és
també
per
a
tres
soques
diferents.
Tercer,
s’ha
presentat
un
model
acoblat
(partint
de
tres
diferents
models:
creixement
cel·∙lular,
transport
d’IPTG
i
producció
de
proteïna).
El
model
de
producció
de
proteïna
usa
com
a
variables
d’entrada
les
evolucions
temporals
de
les
variables
dels
altres
dos
models.
La
velocitat
de
producció
de
proteïna
es
pot
relacionar
amb
la
quantitat
d’inductor
unit
al
repressor.
L’equilibri
d’unió
depèn
de
la
concentració
intracel·∙lular
d’inductor,
que
és
calculada
mitjançant
el
model
de
transport
d’IPTG.
Per
altra
banda,
el
model
de
creixement
cel·∙lular
és
capaç
de
predir
l’evolució
amb
el
temps
de
la
concentració
de
biomassa
i
de
volum
total
en
el
bioreactor,
des
del
principi
de
l’etapa
discontinua.
Per
últim,
el
model
de
producció
de
proteïna,
juntament
amb
el
de
transport
d’inductor,
es
pot
estendre
a
la
producció
d’altres
proteïnes
recombinants
(Fructosa-‐6-‐
Fosfat
Aldolasa
i
ω-‐Transaminasa,
usant
diferents
sistemes
d’expressió.
Per
a
fer-‐ho,
és
necessari
identificar
els
paràmetres
que
son
dependents
del
sistema
d’expressió
i
estimar-‐ne
els
valors.
S’ha
comprovat
que
el
model
és
capaç
de
predir,
acceptablement,
l’evolució
amb
el
temps
de
la
producció
de
les
noves
proteïnes.
En
resum,
aquest
treball
aporta
un
nou
model
que
contribueix
a
la
predicció
de
la
producció
de
proteïnes
recombinants
usant
diferents
sistemes
d’expressió
en
E.coli. / The
present
work
is
focused
on
the
study
of
recombinant
protein
production
in
high-‐
cell
density
fed-‐batch
cultures
of
E.coli.
In
particular,
the
development
of
a
model
capable
to
predict
Rhamnulose-‐1-‐Phosphate
Aldolase
(RhuA)
production
is
the
objective.
Firstly,
a
qualitative
and
quantitative
study
about
the
variables
involved
in
protein
production
has
been
made.
This
study
has
permitted
the
evaluation
of
the
impact
of
the
main
experimental
variables
(inducer
and
biomass
concentration
at
induction
and
the
specific
growth
rate)
on
protein
production
(in
mass
and
activity
units).
Using
a
Response
Surface
Methodology
(RSM),
that
is
a
statistical
methodology,
it
can
be
determined
the
optimal
experimental
conditions
that
conduce
to
a
maximum
in
protein
production,
and
set
the
operating
working
conditions.
Secondly,
because
a
deeper
study
about
the
importance
of
IPTG
in
inducible
E.coli
systems
is
needed,
a
model
describing
inducer
uptake
has
been
developed,
calibrated
and
validated.
IPTG
uptake
model
has
been
developed
in
two
steps:
a)
using
a
lacY
deficient
strain,
non-‐specific
transport
mechanisms
have
been
modeled;
b)
in
addition
to
non-‐specific
transport
mechanisms,
lactose
permeases
(specific
transporting
proteins
for
lactose
–and
IPTG)
contribution
has
been
added.
It
has
been
demonstrated
that
the
model
is
capable
to
predict
IPTG
depletion
from
culture
medium,
not
only
for
the
model
strain,
but
also
for
three
different
strains.
Thirdly,
a
coupled
model,
composed
by
three
different
ones
(biomass
growth,
IPTG
uptake
and
protein
production)
has
been
proposed.
In
this
case,
a
new
protein
production
model
has
been
presented,
using
as
inputs
the
time
evolution
of
the
variables
involved
in
the
other
two
models.
Protein
production
rate
(expressed
in
mass)
can
be
related
to
the
amount
of
inducer
bound
to
the
repressor.
The
binding
equilibrium
depends
on
the
intracellular
concentration
of
IPTG
along
time,
which
is
an
output
of
the
IPTG
uptake
model.
Otherwise,
biomass
growth
model
is
able
to
predict
biomass
concentration
and
the
total
volume
into
the
bioreactor
from
the
beginning
of
the
batch
phase.
Finally,
the
protein
production
model,
coupled
with
the
IPTG
uptake
model,
has
been
extended
to
the
production
of
different
proteins
(Fructose-‐6-‐Phosphate
Aldolase
and
ω-‐Transaminase)
using
different
expression
systems.
In
this
case,
the
expression
system’s
dependent
parameters
have
been
identified,
and
the
model
has
demonstrated
that,
estimating
those
parameters
is
also
capable
to
predict,
properly,
the
protein
production
along
time.
To
sum
up,
this
work
presents
a
new
model,
which
contributes
to
the
prediction
of
protein
production
in
different
inducible
E.coli
expression
systems.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/285076 |
| Date | 14 November 2014 |
| Creators | Calleja Martínez, Daniel |
| Contributors | López Santín, Josep, de Mas Rocabayera, Carles, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 171 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0124 seconds