A eletroporação é um fenômeno que promove a formação de poros na membrana citoplasmática quando esta é submetida à exposição de um campo elétrico específico. Dentre as principais aplicações da eletroporação podemos citar a eletroquimioterapia, uma nova terapia contra o câncer, e a terapia gênica, ainda em desenvolvimento. As conexinas são unidades formadoras das junções gap, canais transmembrana responsáveis pela comunicação intercelular e que participam de uma serie de eventos fisiológicos como o crescimento e diferenciação celular. A importância desta família de genes na oncologia está cada vez mais clara dadas às evidencias de seu comportamento de supressor de tumor ou como facilitador da disseminação e metástases de acordo com a fase de em que o câncer se apresenta. A eletroporação como um fenômeno que promove perturbação em membrana poderia interferir de alguma forma na expressão das conexinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos de interferência na expressão gênica das células promovidos pela eletroporação em especial na família de genes das conexinas. Para tanto as células foram expostas a um campo semelhante a o utilizado para eletroquimioterapia e avaliadas em diferentes tempos após a exposição. Três linhagens, duas neoplásicas (melanoma B16/BL6 e E9) e uma linhagem não neoplásica (E10) foram utilizadas como modelo experimental para que pudesse ser feita uma analise comparativa e a avaliação dos possíveis diferentes comportamentos das mesmas frente à eletroporação. O estudo da expressão gênica foi realizado pelas técnicas de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. A Cx 26 foi avaliada na linhagem B16/BL6 e a Cx 43 nas linhagens E9 e E10. Os resultados da imunofluorescência apontaram uma marcação no citoplasma em B16/BL6, predominantemente em núcleo para a linhagem E9 e em núcleo e citoplasma em E10. Somente a linhagem E9 apresentou diferentes marcações entre os grupos, com uma marcação em citoplasma no grupo t1/2 (30 minutos apos a eletroporacao) O western blot mostrou diminuição transiente para as Cxs apenas nas linhagens neoplásicas nos grupos t1/2 e t1 (1 hora apos a eletroporacao). A linhagem E10 apresentou aumento de expressão nos mesmos grupos. O PCR em tempo real apresentou diferenças significativas nos tempos t1/2 e t1 para as linhagens B16/BL6 e E10. A linhagem B16/BL6 teve diminuição de RNAm enquanto a linhagem E10 apresentou aumento de transcrição de RNAm. A linhagem E9 apresentou padrão de expressão bastante heterogêneo. Frente aos resultados apresentados podemos concluir que a eletroporação interferiu de maneira transiente na expressão de conexinas. / Electroporation is a phenomenon that promotes the formation of pores in the cytoplasmic membrane when it is exposed to a specific electric field. The main applications of electroporation include the electrochemotherapy, a new cancer therapy, and gene therapy, still in development. Connexins are forming units of gap junctions, transmembrane channels responsible for intercellular communication and participating in a series of physiological events such as cell growth and differentiation. The importance of this gene family in oncology is increasing. The evidence of its behavior as a tumor suppressor or facilitator of dissemination and metastases according to the stage where the cancer presents itself. Electroporation as a phenomenon that promotes membrane disruption could interfere somehow in the expression of connexins. The aim of this study was to evaluate the possible effects of interference in gene expression. of cells promoted by electroporation in particular gene family of connexins. For this purpose cells were exposed to a electric field similar to that used for Electrochemotherapy and evaluated at different times after exposure. Three cell lines, two neoplastic (melanoma B16/BL6 and E9) and one line non-neoplastic (E10) were used as experimental models that could provide a comparative analysis between the lines and an assessment of the possible different behaviors due to electroporation. Its expression was assessed by immunofluorescence, western blot and real-time PCR. Cx 26 was evaluated in the melanoma cell line B16/BL6 and Cx 43 in the cell lines E9 and E10. The results showed a cytoplasm immunofluorescence staining pattern in the in B16/BL6, predominantly in the nucleus in line E9 and in the nucleus and cytoplasm for cell line E10. Only the cell line E9 had different immunoflurescence stainings between the groups, with a positivity in the cytoplasm in the group t1/2. The western blot showed transient decrease of Cxs only in cell lines neoplastic in the times t1/2 and t1. The lung cell line E10 showed increased expression in the same time points. The real-time PCR showed significant differences in t1/2 and t1 for the cell lines B16/BL6 and E10. The melanoma cell line B16/BL6 had mRNA decreased while the cell line E10 showed increased transcription of mRNA. The cell line E9 showed a very heterogeneous expression pattern. According to our results, we can conclude that electroporation interfered transiently in the expression of connexins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-25062012-153446 |
| Date | 27 May 2011 |
| Creators | Marcelo Monte Mor Rangel |
| Contributors | Maria Lucia Zaidan Dagli, Lluis Maria Mir, Frederico Azevedo da Costa Pinto, Jose Roberto Machado Cunha da Silva, Idercio Luiz Sinhorini |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Patologia Experimental e Comparada, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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