Os elementos de transposição são seqüências discretas que são capazes de mover- se de um lócus para outro, constituindo uma parte significante do genoma de eucariotos. São agrupados em duas classes principais, os elementos da Classe I, que se transpõem via um intermediário de RNA (retrotransposon), e os elementos da Classe II, que se transpõem via mecanismo de DNA do tipo corta e cola (transposon). A análise das seqüências de um banco de cDNA construído com RNA mensageiro da glândula salivar de Rhynchosciara americana mostrou a presença de representantes das duas classes de elementos. Nesse trabalho caracteriza-se quarto elementos de transposição tipo mariner, onde as seqüências consenso de nucleotídeos foram derivadas de múltiplas cópias defectivas contendo deleções, mudança no quadro de leitura e códons de terminação. Ramar1, um elemento full-length e Ramar2 um elemento defectivo que contém uma deleção na região interna da ORF da transposase, mas mantém e as extremidades intactas. Ramar3 e Ramar4 são elementos defectivos que apresentam muitas deleções no interior da ORF. As seqüências preditas das transposases demostraram que Ramar1 e Ramar2 estão filogeneticamente muito próximos dos elementos mariner da subfamília mauritiana. Enquanto, Ramar3 e Ramar4 pertencem às subfamílias mellifera e irritans, respectivamente. Hibridização in situ mostrou que Ramar1 localiza-se em muitas regiões do cromossomo, principalmente na heterocromatina pericentromérica, enquanto Ramar2 aparece em uma única banda no cromossomo A. Resultado ainda mais curioso foi a caracterização molecular de um elemento de retrotransposição, denominado RaTART, que provavelmente é o responsável pela reconstituição telomérica em R.americana, assim como os elementos TART, HeT-A e TAHRE de Drosophila. Experimentos de Southern Blots do retroelemento RaTART indicam que este está representado por seqüências repetidas no genoma de R.americana, enquanto que Northern Blots mostraram uma expressão em diferentes estágios do desenvolvimento e o transcrito de alto peso molecular detectado representa o retrotransposon non-LTR inteiro. Enquanto a localização cromossômica de RaTART por hibridização in situ mostrou uma marcação predominante nas extremidades dos cromossomos, indicando possivelmente o primeiro elemento de transposição descrito em R.americana com função definida na estrutura do cromossomo. O último retrotransposon, identificado nesse projeto, presente no genoma de R.americana, denominado R2Ra, foi isolado a partir de uma varredura em um banco genômico construído no bacteriófago lambda dash usando como sonda o recombinante pRa1.4 que contém a unidade de repetição do rDNA. A análise da seqüência mostrou a presença de regiões conservadas, como o domínio de transcriptase reversa e o motivo zinc finger na região amino-terminal. O sítio de inserção no gene 28S do rDNA é altamente conservado em R.americana e a análise filogenética mostrou que este elemento pertence ao grupo R2. A localização cromossômica confirma que o elemento móvel R2Ra se insere em um sítio específico no gene rDNA. / Transposable elements are discrete sequences that are able to move from one locus to another within the genome, constituting a significant part of eukaryotic genome. They are grouped into two main types, Class I elements transpose via an RNA intermediate (retrotransposon), and Class II elements transpose via a DNA \"cut-and-paste\" mechanism (transposons). The analysis of sequences of a cDNA bank constructed from mRNA of the salivary glands of Rhynchosciara americana showed the presence of putative types of two classes elements. In the present thesis we describe four mariner elements, where the nucleotides consensus sequences were derived from multiple defective copies containing deletions, frame shifts and stop codons. Ramar1, a full-length element and Ramar2 is a defective mariner element that contains a deletion overlapping most of the internal region of the transposase ORF and the extremities of the element maintain intact. Ramar3 e Ramar4 are defective mariner element that were impossible to predict a complete ORF. Predicted transposase sequences demonstrated that Ramar1 and Ramar2 are phylogenetically very close to mariner-like elements of mauritiana subfamily. However, Ramar3 and Ramar4 belong to mellifera and irritans subfamilies, respectively. In situ hybridisations showed Ramar1 localized in several chromosome regions, mainly in pericentromeric heterochromatin and their boundaries, while Ramar2 appeared as a single band in chromosome A. More interesting data were the molecular characterization of the non-LTR retrotransposon element, called as RaTART, that probably is the responsible by telomeric reconstruction in R.americana, as well as the telomeric retrotransposable elements TART, Het-A and TAHRE of Drosophila. Southern blot analysis indicated that this transposable element is represented by repeat sequences in the genome of R. americana, and Northern blot analysis showed a expression in different developmental stages and the transcript of high molecular mass detected represents the full-length non-LTR retrotransposon. However, the chromosomal localization of the retroelement by in situ hybridisation showed a labelling predominant on chromosome ends, indicating possibly the first transposable element described in R.americana with a defined role in chromosome structure. The last retrotransposon, identified in this project, present in the genome of Rhynchosciara americana, called R2Ra, was isolated from screening of a lambda dash genomic library using as probe the recombinant pRa1.4 of rDNA. The analysis of sequence showed the presence of conserved regions, like transcriptase reverse domain and zinc finger motif in the amino terminal region. The insertion site is high conserved in R.americana and a phylogenetic analysis showed that this element belongs to the R2 clade. The chromosomal localization confirm that the R2Ra mobile element insert into the site specific in rDNA gene.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12062008-100547 |
| Date | 18 April 2007 |
| Creators | Teixeira, Paula Rezende |
| Contributors | Santelli, Gláucia Maria Machado |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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