La canneberge à gros fruits (Vaccinium macrocarpon) est une production très importante au Québec, qui se situe au deuxième rang dans la production mondiale de ce petit fruit. La problématique principale de cette culture réside dans la pourriture du fruit de la canneberge (PFC), dont plusieurs champignons pathogènes sont responsables. Les conséquences de la PFC se traduisent, dans la plupart des cas, par des pertes économiques élevées pour les producteurs, pouvant notamment affecter jusqu'à 33 % de la production. Bien que plusieurs typologies de pourritures - selon les symptômes exprimés - puissent être regroupées dans le complexe de la PFC, de façon générale il est possible de regrouper les différentes pourritures en deux catégories : la pourriture au champ et la pourriture d'entreposage. Encore aujourd'hui, les agents pathogènes responsables de la PFC sont identifiés sur la base d'observations microscopiques des caractères morphologiques du champignon isolé en culture pure, un processus long et imprécis si le diagnosticien n'a pas des connaissances pointues en mycologie. Afin d'améliorer le processus d'identification, le premier volet de ce projet de recherche a été défini pour pouvoir analyser les fruits avec un test de diagnostic spécifique multiplex PCR. Un des avantages de cette technique moléculaire est celui d'éviter les longues étapes nécessaires à l'identification morphologique des champignons impliqués. Douze champignons pathogènes habituellement retrouvés dans les canneberges ont été analysés et, après avoir identifié des zones discriminantes dans leurs régions ITS (internal transcribed spacer), des amorces spécifiques permettant l'amplification de ces zones ont été développées. Ces amorces ont été validées avec les souches pures des 12 champignons pathogènes, ainsi qu'avec des fruits prélevés dans des cannebergières. Les marqueurs moléculaires ont ensuite été assemblés en deux groupes afin de créer et optimiser le test multiplex, subséquemment validé avec 1) l'ADN des 12 souches pures, 2) l'ADN des isolats extraits des canneberges et 3) des mélanges de plusieurs ADN fongiques. Le second volet du projet de doctorat a été construit à partir d'une découverte issue de l'étape de validation de l'outil moléculaire. En analysant les champignons présents dans les fruits pourris échantillonnés en 2017, il a été constaté qu'un champignon, vraisemblablement non inclus dans la liste initiale des 12, se retrouvait de façon récurrente dans les échantillons. Afin de valider l'hypothèse qu'une 13e espèce appartenant à la PFC était présente principalement au Québec, des analyses approfondies ont été menées sur des sections du génome de cette espèce. Étonnamment, ces analyses ont démontré qu'il s'agissait de Godronia cassandrae, une des espèces pourtant visées par l'outil moléculaire. L'erreur provenant d'une mauvaise identification d'une culture pure reçue, le test PCR a été optimisé pour que l'outil moléculaire puisse détecter correctement cette espèce. Cet ajustement a mis en lumière que G. cassandrae occupe le premier rang des agents fongiques responsables de la PFC au Québec, nonobstant le moment d'échantillonnage ou les méthodes culturales des fermes analysées. Le troisième volet du projet a voulu valider l'hypothèse que, grâce au test multiplex, il était possible de dresser un portrait précis des agents pathogènes responsables de la PFC présents au Québec. Ainsi, une analyse à grande échelle de nombreux échantillons venant de trois fermes du Québec a été menée. Pour ce faire, 7825 fruits, repartis sur : i) trois moments d'échantillonnage, ii) trois gestions de culture et iii) huit cultivars différents, ont été analysés avec le test de diagnostic moléculaire. Les résultats obtenus ont indiqué que quatre espèces, G. cassandrae, Colletotrichum fructivorum, Allantophomopsis cytisporea, et Coleophoma empetri étaient systématiquement prédominantes quels que soient les paramètres étudiés. Les productions conventionnelles, par rapport aux productions biologiques, ont montré une réduction significative de la richesse fongique et de l'abondance relative des espèces pathogènes. Par ailleurs, l'analyse comparative des fruits au champ ou en entrepôt, ou entre cultivars, a révélé une surprenante similarité des espèces associées à la PFC. Finalement, le quatrième volet portait sur une analyse plus intensive concernant la pourriture noire. Cette typologie de pourriture est en effet problématique pour les producteurs de l'est du Canada et ce, depuis quelques années. Aujourd'hui la pourriture noire est attribuée à trois champignons : A. cytisporea, Allantophomopsis lycopodina et Strasseria geniculata, mais l'étiologie de la maladie demeure incertaine. Dans le but de démystifier partiellement la pourriture noire, une analyse plus approfondie a été menée, visant non seulement l'analyse des fruits, mais aussi de toutes les parties végétales de l'arbuste. En voulant valider l'hypothèse qu'il est possible de déterminer précisément le stade temporel de propagation des champignons impliqués, ce volet du projet a en effet permis de recueillir des informations utiles au sujet de l'épidémiologie de la pourriture noire. Selon toute évidence, il semblerait que la contamination aurait lieu déjà à la floraison, car des détections significatives ont été observées à ce stade. Parallèlement, la contamination à la récolte ne semblerait pas être la principale porte d'entrée des champignons pathogènes, car des analyses moléculaires menées sur l'eau échantillonnée dans les bassins de canneberge ont démontré que la présence des agents pathogènes dans ces échantillons n'était pas quantifiable. Suite au développement innovateur d'un outil moléculaire pour le diagnostic de la PFC, ce projet de doctorat a permis de fournir des informations précieuses sur la composition fongique de la PFC et d'avancer les connaissances de cette maladie complexe, notamment concernant les quatre espèces fongiques principalement impliquées au Québec. De plus, des nouvelles informations ont permis d'éclairer certains aspects de la pourriture noire, une maladie en voie de devenir de plus en plus problématique au Québec. Ce projet de doctorat a ainsi contribué au développement d'un nouvel outil de diagnostic de la PFC, lequel a permis de générer des informations d'une amplitude sans précédent à l'égard de l'étiologie de la maladie. Ces nouvelles informations pourront être exploitées par les producteurs de canneberges du Canada afin de mieux gérer la PFC. / The American cranberry (Vaccinium macrocarpon) is a very important production in Quebec, which ranks second in the world production of this berry. The main problem with this crop is cranberry fruit rot (CFR) caused by several pathogenic fungi. The consequences of CFR translate, in most cases, into high economic losses for growers since this disease can affect up to 33% of the yearly production. Although several types of rots - depending on the symptoms expressed - can be a part the CFR complex, it is generally possible to group the different rots into two main categories: field rots and storage rots. As of today, the pathogens responsible for CFR are identified on the basis of microscopic observations of the fungus isolated in pure culture, a long and imprecise process if the diagnostician does not have in-depth knowledge of mycology and fungal morphology traits. In order to improve the identification process, the first part of this research project aimed to analyze the fruits with a specific multiplex PCR diagnostic tool. This molecular technique allows to avoid the long steps necessary for the morphological identification of the fungi involved. Twelve pathogenic fungi usually found in cranberries were analyzed and, after having identified discriminating zones in their ITS (internal transcribed spacer) regions, specific primers allowing the amplification of these zones were developed. These primers were validated with pure strains of the 12 pathogenic fungi, as well as with fruits taken from cranberry fields. The molecular markers were then assembled into two groups in order to create and optimize the multiplex test, and subsequently validated with 1) the DNA of the 12 pure strains, 2) the DNA of the isolates extracted from the cranberries and 3) mixtures of several CFR fungal DNA's. The second part of this doctoral project was built from a discovery resulting from the validation step of the molecular tool. By analyzing the fungi present in rotten fruits sampled in 2017, it was found that a fungus, presumably not included in the initial list of targets, was found repeatedly in the samples. In order to validate the hypothesis that a 13th species belonging to the CFR was mainly present in Quebec, in-depth analyzes were carried out on sections of the genome of this species. Surprisingly, these analyzes showed that it was Godronia cassandrae, one of the species targeted by the molecular tool. After determining that one of our pure cultures was wrongly identified, we optimized the PCR test so that the molecular tool could correctly detect this species. This adjustment highlighted that G. cassandrae ranks first among the fungal agents responsible for CFR in Quebec, regardless of the sampling time or the cultural regime of the farms analyzed. The third part of the project sought to validate the hypothesis that, thanks to the multiplex tool, it was possible to draw an accurate portrait of the pathogens responsible for CFR present in Quebec. In order to validate this hypothesis, a large-scale analysis of different samples from three farms in Québec was carried out. To do this, 7825 fruits spread over: i) three sampling times, ii) three cultural regimes and iii) eight different cultivars, were analyzed with the molecular diagnostic tool. The results obtained indicated that four species, G. cassandrae, Colletotrichum fructivorum, Allantophomopsis cytisporea, and Coleophoma empetri were systematically predominant regardless of the parameters studied. Conventional productions, compared to organic productions, showed a significant reduction in fungal richness and relative abundance of pathogenic species. Moreover, the comparative analysis of fruits in field or in storage, or between cultivars, revealed a surprising similarity of species associated with CFR. Finally, the fourth chapter focused on a more intensive analysis concerning black rot. This type of rot has been an acute problem for producers in Eastern Canada for several years. Today, black rot is attributed to three fungi: A. cytisporea, Allantophomopsis lycopodina and Strasseria geniculata, but the etiology of the disease remains uncertain. In order to partially demystify black rot, a more in-depth analysis was carried out, aimed not only at the analysis of the fruits, but also of all plant parts of V. macrocarpon. According to our results, it seems that contamination could already take place at blooming, since significant detections were observed at this stage. At the same time, contamination at harvest does not seem to be the main entry point for pathogenic fungi, since molecular analyses performed on water sampled in cranberries' fields showed that the presence of pathogenic fungi in these samples was not quantifiable. Following the innovative development of a molecular tool for the diagnosis of CFR, this doctoral project provides valuable information on the fungal composition of CFR and advanced knowledge of this complex disease, particularly concerning the four fungal species mainly involved in Quebec. In addition, new information shed some light on certain aspects of black rot, a disease that is becoming increasingly problematic in Quebec. Our results have thus contributed to the development of a new diagnostic tool for CFR, and generated information of an unprecedented magnitude regarding the etiology of the disease. This new information can be exploited by Canadian cranberry growers to better manage CFR.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/73766 |
| Date | 13 December 2023 |
| Creators | Conti, Matteo |
| Contributors | Bélanger, Richard R. |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | thèse de doctorat, COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xix, 114 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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