Bone tissue engineering (BTE) has emerged as a promising solution to heal the millions of people worldwide that suffer from bone degenerative pathologies and bone fractures. Since bone is a biocomposite of type I collagen nanofibres (namely osteoid) reinforced with nanocrystals of carbonated hydroxylapatite (CHA), reconstituted type I collagen gels are an attractive choice as scaffolds for BTE. However, to date, the design of a collagenous bone-like construct ready to be implanted is far from being accomplished, as collagen matrices are difficult to mineralize. The aim of this doctoral research was to design and evaluate strategies to rapidly achieve an acellular mineralization of an osteoid-like dense collagen gel for potential applications in bone regeneration. It was hypothesized that the collagen fibrillar density (CFD) affects the microenvironment and the physical properties of the framework of collagen gels. To test this hypothesis, and as a first objective, the mineralization of collagen gel with increasing CFDs was investigated in simulated body fluid (SBF). Collagen gels with physiologically relevant CFDs led to greater extent of mineralization, when compared to highly hydrated gels. It was therefore proposed that the increase in gel CFD led to a more physiological microenvironment, which facilitated the mineral formation and validated the proposed osteoid model. As a second objective, the mineralization of dense collagen (DC) gels was enhanced and accelerated by mimicking the role of anionic non collagenous proteins (NCPs) in the native osteoid, which act as CHA nucleators. Two strategies were implemented: first, the influence of collagen fibrillization pH on the extent of DC gel mineralization was investigated. Since the collagen molecule is slightly positively charged at physiological pH, it was hypothesized that it would be more negatively charged if formed in an alkaline environment, i.e., above its isoelectric point. This hypothesis was validated by investigating the electrostatic properties of collagen gels formed at physiological pH (7.4) and at pH values of 8.2 and 9.0. The effect of alkaline fibrillization pH on DC gel mineralization was evident by the extensive mineralization and the soft to hard transition of the gels by day 14 in SBF. Second, anionic fibroin derived polypeptides (Cs) were introduced, for the first time as easily produced alternatives to NCPs. Apatite was formed within 6 hours in SBF and by day 7, CHA crystals were homogenously distributed throughout the roll gels resulting also in a transition from soft-to-hard tissue-like response to compressive testing. As a third objective, a bioinorganic approach to enhance and accelerate the mineralization of collagen was developed. DC gels were combined with silica-based 45S5 bioactive glass of micron- and nano-sized particles (μBG and nBG, respectively) to investigate the effect of an osteoconductive and osteoinductive bioactive glass on collagen mineralization. DC-μBG gels conditioned in SBF resulted in the extensive mineralization of the collagenous framework. Furthermore, the effect of nBG on the mineralization of DC and its effect on seeded pre-osteoblastic cells, were also investigated. Compared to μBG, nBG particles resulted in an enhanced and accelerated mineralization of the collagen matrix when immersed in SBF. Apatite formation was immediately detected within as processed DC-nGB hybrid gels, and by day 7 there was a 13 fold increase in the hybrid gel scaffold compressive modulus. The metabolic activity of MC3T3-E1 cells was affected by the presence of nBG, indicating accelerated osteogenic differentiation in the absence of osteogenic supplements, suggesting the potential of DC-nBG scaffolds to be used as cell-seeded constructs. In conclusion, since the role of the collagen framework microstructure on its mineralization has been previously ignored, the present doctoral dissertation provides new insights into collagen mineralization. / Des millions de personnes dans le monde souffrent de maladies osseuses. Les techniques chirurgicales actuelles font appel à l'autogreffe, à l'allogreffe, à la xénogreffe et à la greffe de matériaux artificiels. Cependant, comme ces interventions comportent plusieurs inconvénients, l'ingénierie tissulaire de l'os (ITO) est apparue comme une solution prometteuse. Comme l'os est un biocomposite constitué de nanofibres de collagène de type I renforcées de nanocristaux d'hydroxylapatite carbonatée (HAC), les gels de collagène de type I représentent un choix attrayant pour la production de ces matrices. Toutefois, la minéralisation in vivo de ces matrices de collagène est difficile et la minéralisation in vitro n'est obtenue qu'après avoir soustrait les matrices des contraintes physiologiques, ce qui limite leur utilisation.Ces travaux s'appuyaient sur l'hypothèse selon laquelle la densité en fibrine du collagène (DFC) influe sur le microenvironnement et les propriétés physiques de la charpente de gels de collagène. Afin de vérifier cette hypothèse, et d'atteindre l'objectif premier de l'essai, la minéralisation de gel de collagène d'une DFC croissante a été réalisée dans du liquide organique simulé (LOS). Les gels de collagène d'une DFC physiologique ont permis d'obtenir une plus grande minéralisation et a aussi influé sur les propriétés électrostatiques des gels. Cette découverte suggère donc que l'augmentation de la DF du gel de collagène a permis de créer un microenvironnement plus physiologique, ce qui a facilité la formation minérale et a permis de valider le modèle proposé. Comme deuxième objectif, la minéralisation de gels de collagène dense a été améliorée et accélérée en reproduisant le rôle des protéines anioniques (PANC) au sein des ostéoïdes indigènes. Deux stratégies ont été mises en œuvre : étude de l'influence du pH des fibrines du collagène et de polypeptides anioniques dérivés de la fibroïne. Premièrement, la charge de la molécule de collagène étant légèrement positive dans un milieu doté d'un pH physiologique l'hypothèse est que un milieu dont le pH se situe au-dessus de son point isoélectrique, a été posée et validée. L'effet du pH alcalin durant la formation de fibrines sur la minéralisation du gel de collagène dense a été constaté par la quantité d'HAC formée; la matrice s'était largement minéralisée au jour 3. De plus, la minéralisation a significativement augmenté le module apparents des gels, rendant les structures autoportantes. Deuxièmement, la minéralisation de gels de collagène dense additionnés de 10 % poids de polypeptides anioniques dérivés de la fibroïne a été évaluée dans du LOS. De l'apatite s'était formée dans les 6 heures et des cristaux d'HAC étaient distribués de façon homogène dans les rouleaux de gels au jour 3.Le troisième objectif a été la mise au point d'une approche bio-inorganique en vue d'améliorer et d'accélérer la minéralisation du collagène. Des gels de collagène dense ont été additionnés de micro- et de nanoparticules de verre bioactif (μBG et nBG, respectivement) 45S5 à base de silice. Les gels de collagène dense additionnés de μBG préparés dans un LOS ont produit une importante minéralisation de la matrice de collagène. De plus, l'effet des nBG sur la minéralisation du collagène dense et son effet sur des cellules préostéoblastiques ensemencées ont aussi été étudiés. La formation d'apatite a immédiatement été détectée par la présence de gels hybrides de collagène dense contenant des nBG. Au jour 7, le module à la compression de la construction de gel hybride était 13 fois plus élevé. De plus, l'activité métabolique des MC3T3 cellules a été altérée par la présence des nBG, indiquant une différenciation ostéogénique accélérée en l'absence de suppléments ostéogéniques.En conclusion, le rôle des matrices de collagène à microstructures dans la minéralisation ayant été ignoré jusqu'ici, la présente dissertation doctorale jette un nouvel éclairage sur la minéralisation du collagène.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.106503 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Marelli, Benedetto |
| Contributors | Jake Barralet (Internal/Cosupervisor2), Showan Nazhat (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Mining and Materials) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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