Encara
que
els
gens
de
resistència
a
antibiòtics
són
una
eina
important
per
a
la
selecció
i
manteniment
de
plàsmids
recombinants,
les
autoritats
reguladores
consideren
el
seu
ús
inacceptable
en
diverses
àrees
dins
la
indústria
biotecnològica,
sobretot
quan
el
producte
serà
utilitzat
amb
finalitat
terapèutica.
Un
sistema
d’expressió
basat
en
el
vector
pQE
(Quiagen)
amb
un
marcador
de
selecció
plasmídic
alternatiu
(basat
en
l’auxotròfia
de
glicina)
va
ser
desenvolupat
prèviament
(Vidal
et
al.,
2008).
El
sistema
d’expressió
pQE
es
basa
en
el
promotor
T5,
induïble
per
IPTG.
La
no-‐
estabilitat
del
promotor
en
absència
d’inductor
pot
provocar
una
inestabilitat
estructural
del
vector,
que
portarà
a
nivells
baixos
d’expressió
deguts,
per
exemple,
a
fenòmens
de
recombinació
a
la
regió
del
promotor
T5.
El
repressor
lac,
codificat
pel
gen
lacI,
s’uneix
molt
fortament
al
promotor,
interferint
en
la
transcripció
del
gen
d’interès.
Així
doncs,
els
nivells
transcripcionals
del
gen
lacI
tenen
un
paper
crític
en
els
sistemes
d’expressió
basats
en
el
promotor
T5,
influenciant
els
nivells
basals
de
transcripció
i
la
concentració
d’inductor.
Encara
que
la
sobreexpressió
de
la
proteïna
d’interès
és
un
factor
important
en
quant
a
càrrega
metabòlica,
també
cal
tenir
en
compte
la
contribució
deguda
a
l’expressió
d’altres
gens
plasmídics.
En
aquest
sentit,
per
tal
de
millorar
la
robustesa
del
sistema
i
minimitzar
la
càrrega
metabòlica
relacionada
amb
els
gens
codificats
als
plàsmids,
s’han
eliminat
tots
els
gens
de
resistència
a
antibiòtics
i
s’han
afinat
els
nivells
d’expressió
del
marcador
auxotròfic
(glyA)
i
del
repressor
lac
(lacI).
En
aquest
treball
s’han
construït
uns
cassettes
d’expressió
on
els
gens
lacI
i
glyA
estan
sota
el
control
d’un
seguit
de
promotors
constituents
sintètics,
per
tal
d’obtenir
suficient
inhibidor
lacI
per
evitar
la
“no-‐estabilitat
del
promotor”
i
assegurar
el
nivell
mínim
de
transcripció
de
glyA
necessaris
tant
per
al
manteniment
del
plàsmid
com
per
al
correcte
creixement
del
cultiu
en
medi
definit.
A
més,
el
gen
de
resistència
a
antibiòtic
en
el
vector
d’expressió
va
ser
reemplaçat
per
la
construcció
glyA-‐lacI,
obtenint
un
sistema
totalment
lliure
de
gens
per
a
la
resistència
a
antibiòtic.
Finalment,
s’ha
estudiat
la
capacitat
per
a
la
sobreexpressió
de
FucA
recombinant
a
diferents
escales
(flascons
agitats
i
bioreactor)
i
en
diversos
modes
d’operació
(discontinu
i
discontinu
alimentat)
per
tal
d’obtenir
alts
nivells
d’expressió.
Per
últim,
per
tal
d’analitzar
la
població
bacteriana
a
nivell
de
cèl·∙lules
individuals,
els
canvis
morfològics
(FSC
i
SSC)
i
les
característiques
físiques
i
bioquímiques
de
les
diferents
cèl·∙lules
dins
la
població
bacteriana,
s’han
realitzat
anàlisis
de
citometria
de
flux. / While
antibiotic
resistance
marker
genes
are
a
powerful
system
for
selection
and
maintenance
of
recombinant
plasmids
in
hosts
such
as
E.
coli,
its
use
has
been
considered
unacceptable
in
many
areas
of
biotechnology
by
regulatory
authorities,
particularly
when
the
recombinant
product
will
be
used
in
the
therapeutic
field.
Previously,
we
have
developed
an
expression
system
based
on
the
pQE
vector
series
(Qiagen)
with
an
alternative
plasmid
selection
marker
based
on
glycine
auxotrophy
complementation
(Vidal
et
al.,
2008).
The
pQE
expression
system
is
based
on
the
IPTG-‐induced
T5
promoter.
Promoter
leakiness
in
inducer
absence
may
lead
to
structural
instability
of
the
expression
vector,
resulting
in
reduced
expression
levels,
e.g.
due
to
recombination
events
in
the
T5
promoter
region.
The
lac
repressor,
encoded
by
the
lacI
gene,
binds
very
tightly
to
the
promoter,
interfering
with
the
transcription
of
the
gene
of
interest.
Therefore,
lacI
transcriptional
level
plays
a
key
role
in
T5
promoter-‐based
expression
systems,
influencing
the
basal
transcriptional
levels
and
the
concentration
of
inducer.
Furthermore,
although
the
overexpression
of
the
plasmid-‐encoded
protein
of
interest
is
a
major
factor
in
the
metabolic
burden,
expression
of
other
plasmid-‐genes
may
also
contribute.
Thus,
in
order
to
improve
the
system
robustness,
all
the
antibiotic
resistance
genes
have
been
removed
and
the
expression
levels
of
the
auxotrophic
marker
(glyA)
and
the
lac
repressor
(lacI)
genes
have
been
fine-‐tuned,
in
order
to
minimize
the
metabolic
burden
related
to
plasmid-‐encoded
genes.
In
this
study,
an
expression
cassette
has
been
constructed
where
the
lacI
and
glyA
genes
have
been
placed
under
the
control
of
selected
synthetic
constitutive
promoters
in
order
to
obtain
the
sufficient
lacI
inhibitor
ensuring
lack
of
“promoter
leakiness”
and
the
minimal
glyA
transcriptional
levels
needed
for
plasmid
maintenance
and
optimal
cell
growth
in
defined
media.
Moreover,
in
the
expression
vector
the
antibiotic
resistance
gene
was
replaced
by
the
lacI-‐glyA
cassette,
thus
yielding
a
completely
antibiotic
resistance
gene
free
system.
Finally,
in
order
to
obtain
high
expression
levels
of
the
protein
of
interest,
the
capacity
for
recombinant
FucA
overexpression
has
been
investigated
at
different
scales
(shake
flasks
and
bioreactors)
and
operation
modes,
batch
and
fed-‐batch.
Lastly,
flow
cytometry
analyses
were
performed
in
order
to
analyze
the
bacterial
populations
at
the
single-‐cell
level:
changes
in
morphology
(FSC
and
SSC)
and
physical
and
biochemical
characteristics
of
individual
cells
within
a
bacterial
population.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/330368 |
| Date | 18 December 2015 |
| Creators | Pasini, Martina |
| Contributors | Ferrer Alegre, Pau, de Mas Rocabayera, Carles, Caminal Saperas, Gloria, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 265 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | L'accés als continguts d'aquesta tesi queda condicionat a l'acceptació de les condicions d'ús establertes per la següent llicència Creative Commons: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/es/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0026 seconds