Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / En vue d'améliorer l'incorporation des acides nucléiques (ADN génomique de sperme de saumon, ARN de levure et plasmide pBR322) dans les liposomes cationiques DOPE:DOTAP
(1,2-dioléoylephosphatidyléthanolamine, 1,2-dioléoyle-3-triméthylammonium propane), l'influence du chauffage sur les porteurs liposomaux d'acides nucléiques a été déterminée par analyse spectrofluorimétrique avec le bromure d'éthidium (BrEt) et l orange d' acridine.
La petite taille du plasmide pBR322 de forme circulaire et sa structure plus compacte, facilitent considérablement son incorporation dans les liposomes cationiques DOPE:DOTAP, comparée à celle obtenue avec l'ADN génomique de sperme de saumon ou avec l'ARN de levure. La linéarisation du plasmide pBR322 améliore significativement son incorporation dans les liposomes cationiques DOPE:DOTAP. Le plasmide pBR322 linéarisé s'insère plus aisément entre les chaînes du poly(éthylène) glycol (PEG), insérées à la surface des liposomes cationiques DOPE:DOTAP. L'effet de "barrière stérique des dérivés de distéaroylephosphatidyléthanolamine PEG (DSPE-PEG) à la surface des liposomes cationiques DOPE:DOTAP, s'atténue à mesure qu'on élève la température de chauffage.
Le plasmide pBR322 libre ou incorporé dans les liposomes DOPE:DOTAP présente une activité au sein des bactéries E. coli. Les complexes pBR322-DOPE:DOTAP confèrent aux bactéries E. coli l'expression d'une résistance à l'ampicilline et à la tétracycline, nettement supérieure à celle obtenue avec le plasmide libre précipité au chlorure de calcium et introduit par choc de chaleur dans les bactéries E. coli.
L'élévation de la température de chauffage des complexes pSV-I3-Gal-DOPE:DOTAP est accompagnée par une diminution de l'expression du plasmide pSV-13-Gal dans les cellules de mammifères Cos-7, à cause notamment de la dénaturation du plasmide pSV-13-Gal. Néanmoins, l'incorporation du plasmide pSV-13-Gal dans les liposomes cationiques DOPE:DOTAP "pegylés" ou non, protège davantage l'ADN contre sa dégradation par les nucléases intracellulaires ou extracellulaires et assure des activités de transfection du plasmide pSV-B-Gal dans les cellules Cos-7, jusqu'à 10 fois plus élevées que celles obtenues lors de la précipitation du plasmide pSV-13-Gal au phosphate de calcium. L'efficacité de transfection du plasmide pSV-13-Gal dans les cellules Cos-7, est largement dépendante de la concentration du plasmide pSV-13-Gal et des lipides cationiques DOTAP, de la composition du milieu de pré-incubation (absence ou non de sérum), ainsi que du temps de pré-incubation des complexes dans le milieu de culture des cellules Cos-7.
La stabilité des porteurs liposomaux d'ADN en présence de 10% de sérum de veau, de déoxycholate de sodium (SDS), de lipoprotéines du plasma sanguin humain HDL, LDL et VLDL et des composants du milieu synovial, a été évaluée par spectroscopie de corrélation de photons, en mesurant les changements de diamètre (agrégation) des liposomes cationiques DOPE:DOTAP. Le potentiel zêta () liposomal et la rétention de l'ADN plasmidique au sein des liposomes cationiques DOPE:DOTAP ont été déterminés respectivement, par dispersion électrophorètique de Doppler et par analyse spectrofluorimétrique avec le BrEt.
Les liposomes cationiques DOPE:DOTAP s'agrègent fortement et subissent une diminution significative de leur potentiel en présence de 10% de sérum de veau, de SDS, de lipoprotéines du plasma sanguin humain et des composants du milieu synovial. Malgré une protection accrue des liposomes DOPE:DOTAP-DSPE-PEG5000 vis-à-vis des effets déstabilisants de l'acide hyaluronique (AH) et du sulfate de chondroïtine A (CSA), le DSPE-PEG5000 n'inhibe pas la capacité de molécules linéaires et anioniques comme AH, de s'insérer entre les chaînes de PEG et d'induire la libération de l'ADN liposomal.
Des études en résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) ont suggéré une saturation très rapide des sites d'insertion des dérivés de DSPE-PEG à la surface des liposomes cationiques DOPE:DOTAP. La présence de dérivés de DSPE-PEG incorporés à la surface des liposomes cationiques DOPE:DOTAP, confère une plus grande protection aux liposomes DOPE:DOTAP vis-à-vis de leur déstabilisation par les constituants biologiques étudiés, et améliore grandement leur durée d'entreposage à de basses températures (-20°C et 4°C). Cependant, la couche hydrophile de PEG à la surface de ces liposomes constitue une "barrière stérique qui limite la quantité d'ADN pouvant être incorporée dans les liposomes cationiques. Le PEG interfère probablement en partie, avec la capacité des complexes ADN-DOPE:DOTAP d'interagir avec les membranes cellulaires et d'assurer le transport et l'expression efficaces de l'ADN dans le noyau.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/33646 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Khalifé, Sophie |
| Contributors | Philips, Nigel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | fra |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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