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Previous issue date: 2009-04-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Using recombinant DNA techniques, the lipase BTL2 gene of Bacillus thermocatenulatus was cloned in E. coli BL321 under control of the strong temperature-inducible λPL promoter. It
was investigated, initially, in this work, the influence of different variables in cell growth and expression of lipase BTL2 by recombinant E. coli, through experiments performed in agitated flasks with LB medium. First, it was studied the influence of temperature of growth (between 27 ° C and 34.2 °C) and heat shock temperature (between 37.8 °C and 46.2 °C) in the expression of lipase BTL2 by E. coli recombinant, using statistical design of experiments. The results of this study, where the shock was performed in the early exponential phase, indicated as the best Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, yielding cellular concentration of 0.6 g dry
weight / L and enzyme activity of 121.000 U/g.wet.cel. Then, it was investigated the influence of the growth phase of the microorganism at the shock, through cultures with Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, the results of these experiments showed how heat shock condition at the end of exponential phase, resulting in activity of 258.000 U/g.wet.cel It investigated the influence of different initial concentrations of glucose in the medium on cell growth and expression of the enzyme. The best results were obtained from cell mass with 10 g/L glucose and μmax = 0,16 h-1, Yx/s = 0,19 g/g, resulting in 1.2 g / L dry cel, enzymatic activity of about 250.000 U / g.wet.cel. Lower concentrations of glucose and higher concentrations led to smaller cell, but did not affect enzyme activity in the final. Based on previous cultures of
E.coli were conducted simulations to calculate the best condition for feed-batch. The experimental test was performed with 10 g/L glucose at the beginning of cultivation, Tcresc = 30 °C, Tchoque = 45 °C. In this test, we were able to achieve 15 g/L dry.cel μmax = 0,38 h-1 with enzyme activity of 231.000 U/g.wet.cel, with resulting in 100 times more enzyme in this test than in cultivation in shaker in the best condition. The results of the simulation, obtained using model of Monod, predicted quite well those obtained experimentally. There was no significant accumulation of organic acids and all aminoacids consumed by the moment of
shock. From the heat shock, those who were not exhausted with concentration remained constant. The enzyme produced in the test batch was recovered by breaking the cells in a
French press to obtain with this methodology 272.000 U/g wet cells, whereas the results of the samples, which were disrupted by sonication resulted in much lower value. Was then investigated the efficiency of the protocol of sonication that was being used, by subjecting the cells to successive rounds of sonication. The results showed that actually the first cycle only 50% of the enzyme was released, indicating that the maximum production achieved was actually around 462.000 U/gcél.úmida. Study characterization of enzyme kinetics showed that the temperature of maximum activity is 65 °C with activation energy equal to 142.3 kJ/mol. Study of stability in solvent showed that the enzyme retains activity in the presence of 2- propanol. / Utilizando técnicas de DNA recombinante, o gene da lípase BTL2 de Bacillus thermocatenulatus foi clonado em E. coli BL321 sob controle do promotor λPL, com o qual a indução na produção da enzima é obtida através de choque térmico. Investigou-se, inicialmente, neste trabalho, a influência de diferentes variáveis no crescimento celular e na expressão da lípase BTL2 por E.coli recombinante, através de experimentos realizados em frascos agitados, com meio LB. Primeiramente, estudou-se a influência da temperatura de crescimento (entre 27°C e 34,2°C) e da temperatura de choque térmico (entre 37,8°C e 46,2°C) na expressão de BTL2 por E.coli recombinante, usando planejamento estatístico de experimentos. Os resultados desse estudo, onde o choque era realizado no início da fase exponencial, indicaram como as melhores temperaturas Tcresc=27°C e Tchoque=45°C, obtendose concentração celular de 0,6 g massa seca/L e atividade enzimática de 121.000U/gcél.úmida. A seguir, foi investigada a influência da fase de crescimento do
microrganismo no momento do choque, através de cultivos com Tcresc=27°C e Tchoque =45°C, os resultados desses experimentos indicaram como melhor condição choque térmico no final da fase exponencial, obtendo-se nessa condição atividade de BTL2 de 258.000U/gcél. Úmida. Investigou-se assim a influência de diferentes concentrações iniciais de glicose no meio de cultivo no crescimento celular e expressão da enzima. Os melhores resultados de massa celular foram obtidos com 10g/L de glicose, obtendo-se 1,2 g/L de massa seca, μmax = 0,16 h- 1, Yx/s=0,19 g/g e atividade enzimática em torno de 250.000 U/gcél, úmida. Concentrações de
glicose menores e maiores conduziram a menores concentrações celulares, mas não influenciaram na atividade enzimática final. Baseando-se em cultivos anteriores de E.coli
foram realizadas simulações para cálculo de alimentação de meio em ensaio em batelada alimentada. O ensaio experimental foi realizado com 10 g/L de glicose no início do cultivo, Tcresc=30°C, Tchoque=45°C. Nesse ensaio, conseguiu-se atingir 15 g/L de massa seca, com μmax
=0,38 h-1 e com atividade enzimática de 231.000 U/gcel.úmida, obtendo-se 100 vezes mais enzima nesse ensaio do que no cultivo em frasco agitado na melhor condição. Os resultados da simulação, obtidos usando modelo de Monod, previram bastante bem os obtidos experimentalmente. Não se observou acúmulo significativo de ácidos orgânicos e todos os aminoácidos.eram consumidos até o momento do choque. A partir do choque térmico, aqueles
que não estavam esgotados permaneceram com concentração constante. A enzima produzida no ensaio em batelada foi recuperada rompendo-se as células em uma prensa francesa, obtendo-se com essa metodologia 272.000 U/g cel úmida, enquanto que os resultados das amostras , que eram rompidas por sonicação resultaram em valor muito menor. Investigou-se então a eficiência do protocolo de sonicação que vinha sendo utilizado, submetendo-se as
células a sucessivos ciclos de sonicação. Os resultados mostraram que realmente no primeiro ciclo apenas 50% da enzima era liberada, o que indica que a máxima produção obtida estava na verdade em torno de 462.000U/gcél.úmida.Estudo de caracterização cinética da enzima mostrou que a temperatura de máxima atividade é 65°C, com energia de ativação igual a 142,3 kJ/mol. Estudo de estabilidade em solvente mostrou que a enzima mantém atividade na presença de 2-propanol.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/4013 |
| Date | 03 April 2009 |
| Creators | Escallón, Ana María Vélez |
| Contributors | Giordano, Raquel de Lima Camargo |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Engenharia Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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