Les phosphoinositides (PIs) sont des phospholipides membranaires qui jouent un rôle crucial dans le contrôle de l'organisation spatio-temporelle de nombreuses voies de signalisation intracellulaire, du réarrangement du cytosquelette d'actine et du trafic de vésicules. Dans la plaquette, le métabolisme des PIs est particulièrement actif et génère, par le jeu de kinases, phosphatases et phospholipases spécifiques, des seconds messagers indispensables à l'activation plaquettaire, notamment le phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). La première partie de la thèse concerne l'étude des différentes espèces moléculaires (composition en acides gras) des 4 grandes classes de PIs (PI, PIP, PIP2 et PIP3) dans les plaquettes humaines et de souris au repos ou lors de leur activation. Cette analyse, jamais réalisée précédemment, a été possible grâce à une technique de spectrométrie de masse (LC-MS), basée sur la méthylation avec le TMS-diazomethane des groupements phosphates des PIs. Cette étude montre une augmentation rapide et transitoire de 2 espèces moléculaires majoritaires de PIP3 lors d'une stimulation plaquettaire avec une réactivité différente des plaquettes humaines et de souris en réponse aux agonistes plaquettaires (thrombine et CRP). En utilisant des modèles murins présentant une inactivation des PI3-kinases (PI3K) dans la lignée mégacaryocytaire et des inhibiteurs spécifiques de PI3K, j'ai montré que l'isoforme PI3Kß (p110ß) de classe I est très majoritairement responsable de la production des diverses espèces moléculaires de PI(3,4,5)P3 en réponse à la thrombine ou au CRP alors que la PI3Ka (p110a) est faiblement impliquée. Les résultats montrent également une grande variété d'espèces moléculaires de PI et seulement 2 espèces moléculaires prédominantes pour les PIP, PIP2 et PIP3, aussi bien chez l'homme que chez la souris malgré des régimes alimentaires très différents. Nous montrons des différences importantes dans le métabolisme des espèces moléculaires de PI, PIP et PIP2 dans les plaquettes humaines et de souris lors de la stimulation. Dans cette étude, nous avons identifié pour la première fois des espèces moléculaires minoritaire de PIP2 mais qui augmentent de façon importante lors de la stimulation plaquettaire. Ce travail permet de dresser la première cartographie des différentes espèces moléculaires de PIs présents dans les plaquettes humaines et de souris et les modifications induites par leur activation. La deuxième partie de la thèse montre pour la première fois une localisation atypique du phosphatidylinositol 3- monophosphate (PI3P), dans le feuillet externe de la membrane plasmique plaquettaire. Je démontre que ce lipide minoritaire (environ 10% de PIP), connu pour être intracellulaire et impliqué dans le trafic vésiculaire, est également présent à la surface des plaquettes au repos. Aucun autre PI n'a pu être détecté dans le feuillet externe de la membrane plasmique plaquettaire. Ce résultat a été obtenu en utilisant différentes sondes fluorescentes se liant spécifiquement au PI3P et leurs contrôles mutées. Nous montrons que le traitement des plaquettes avec des enzymes métabolisant spécifiquement le PI3P (MTM1 et ABH) réduit significativement ce pool de PI3P. Les plaquettes de souris déficientes en PI3K de classe II et III présentent une diminution du PI3P de surface. De manière intéressante, ce pool externe de PI3P permet l'endocytose des protéines circulantes liant le PI3P, in vitro, ex vivo et in vivo. Les sondes PI3P spécifiques internalisées dans la plaquette sont stockées dans les granules a puis sécrétées lors de l'activation plaquettaire. Cette étude montre que le PI3P se comporte comme un récepteur permettant l'endocytose de protéines plasmatiques spécifiques. / Phosphoinositides (PIs) are membrane phospholipids that play a crucial role in controlling the spatiotemporal organization of many intracellular signaling pathways, actin cytoskeleton rearrangement, and vesicle trafficking. In platelet, the metabolism of PIs is highly active and generates, by the interplay of specific kinases, phosphatases and phospholipases, second messengers essential for platelet activation, in particular phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3). The first part of the thesis concerns the study of the different molecular species (fatty-acyl composition) of 4 PIs classes (PI, PIP, PIP2 and PIP3) in resting and stimulated human and mouse platelets. This analysis, never realized previously, was possible thanks to a mass spectrometry (LC-MS) technique, based on methylation of PIs phosphates groups with TMS- diazomethane. This study shows a rapid and transient increase in the 2 major molecular species of PIP3 during platelet stimulation with a different reactivity of human and mice platelets according to the used agonists (thrombin and CRP). Using mice models with selective deletion of PI3-kinases (PI3K) in the megakaryocyte lineage and specific PI3K inhibitor, I showed that the class I PI3Kß (p110ß) is the major isoform responsible for the production of the various molecular species of PIP3 in response to thrombin or CRP whereas class I PI3Ka (p110a) is weakly involved. The results also show a large variety of molecular species of PI while only 2 predominant molecular species for PIP, PIP2 and PIP3, both in humans and mice platelets despite very different diet. We show a significant difference in terms of PI, PIP and PIP2 molecular species metabolism in human and mice platelets during stimulation. In this study, we identified for the first time the presence of low-abundance molecular species of PIP2 but which increase significantly during platelet stimulation. This work constitutes the first comprehensive analysis of PIs molecular species and the changes in their actual mass during platelet stimulation. The second part of the thesis shows for the first time an atypical localization of phosphatidylinositol 3-monophosphate (PI3P), in the outer leaflet of the platelet plasma membrane. I demonstrate that this minor lipid (about 10% of PIP), known to be intracellular and involved in vesicular trafficking, is also present at the surface of resting platelet. No other PIs could be detected in the outer leaflet of the platelet plasma membrane. This result was obtained using fluorescent probes binding specifically to PI3P and their mutated controls. Treatment of platelets with PI3P specific metabolizing enzymes (MTM1 and ABH) significantly reduced this particular pool of PI3P. Class II and III PI3K deficient mouse platelets showed a decrease in surface PI3P. Interestingly, this external pool of PI3P was able to mediate endocytosis of circulating PI3P- binding proteins, in vitro, ex vivo and in vivo. Internalized specific PI3P probes were stored into platelets a-granules and could then be secreted during platelets activation. This study shows that PI3P acts as a receptor allowing endocytosis of specific plasma proteins.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2018TOU30110 |
| Date | 20 April 2018 |
| Creators | Mujalli, Abdulrahman |
| Contributors | Toulouse 3, Terrisse, Anne-Dominique, Payrastre, Bernard |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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