Die Photoaktivierte Adenylatzyklase PAC ist in E. gracilis an der Phototaxis beteiligt und besteht aus den zwei unterschiedlich großen Proteinen PACalpha und PACbeta. Beide besitzen jeweils zwei FAD bindende (BLUF) Domänen F1 und F2 sowie zwei Zyklasedomänen C1 und C2. An den Zyklasedomänen findet die Umsetzung von ATP in cAMP statt und die BLUF-Domänen werden für die Lichtaktivierung benötigt. Für diese Arbeit wurde PAC und Mutanten davon heterolog in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert. PAC besitzt bereits im Dunkeln Adenylatzyklaseaktivität, die durch Belichtung erhöht werden kann. Die Zunahme der Aktivität erfolgt mit einer Zeitkonstante von unter 100 ms, die Abnahme nach der Belichtung hat eine Zeitkonstante im Bereich von 10ms. Das für die katalytische Umsetzung in allen Klasse III Nukleotidzyklasen benötigte Dimer zweier Zyklasedomänen ist in PAC das Dimer aus C1 und C2. Durch Messungen mit PAC-Mutanten, bei denen jeweils eine Zyklasedomäne defekt war, konnte gezeigt werden, dass diese Dimerisierung in PACalpha intermolekular auftritt. Ebenso wurde gezeigt, dass ein solches Dimer aus Zyklasedomänen von PACalpha und PACbeta bestehen kann. Der Austausch der Zyklasedomänen von PACalpha durch Zyklasedomänen der Guanylatzyklasen GCY35 und GCY36 aus C. elegans führte zu einem Verlust der Zyklaseaktivität. Die Proteine wurden aber zumindest teilweise korrekt gefaltet, was durch Dimerbildung mit Knockoutmutanten von PAC in Koexpressionsexperimenten gezeigt werden konnte. Die Fusionsproteine aus PACalpha und den CNG-Kanälen CNGA2 und OLF führten in Oocyten zu einer deutlich geringeren Leitwertänderung als eine Expression der Einzelproteine. Sowohl bei einer N-terminalen Fusion des Kanals an PAC als auch bei der C-terminalen Fusion war es jeweils der Kanal, der im Fusionsprotein stark gehemmt war. Eine Deletion des C-Terminus von PACalpha führte zu einem nicht funktionsfähigen Protein, das auch in Koexpression mit PAC-Knockoutmutanten keine messbare Adenylatzyklaseaktivität zeigte. Wurde die F2-Domäne deletiert, so verlor PAC ebenfalls seine Zyklaseaktivität vollständig. Die C1-Domäne war aber korrekt gefaltet, was durch eine Koexpression mit PAC-Mutanten gezeigt werden konnte, die in einer ihrer Zyklasedomänen defekt waren. Beide Chimären aus PACalpha und PACbeta besaßen Adenylatzyklaseaktivität. Diese war bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACalpha deutlich höher als bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACbeta, was darauf hindeutet, dass im C-terminalen Teil von PAC der Grund für den Aktivitätsunterschied zwischen PACalpha und PACbeta liegt. Für die Veränderung der Substratspezifität von einer Adenylat- zu einer Guanylatzyklase waren Mutationen an mindestens drei Aminosäuren erforderlich. Die ebenfalls hergestellten Einzel- und Doppelmutanten verhielten sich wie der Wildtyp oder hatten eine deutlich eingeschränkte Adenylatzyklaseaktivität. Bei der Tripelmutante PACalpha K250E T319G S329Y war Guanylatzyklaseaktivität nachweisbar, die aber geringer war als die noch vorhandene Adenylatzyklaseaktivität. Die Quadrupelmutante PACalpha K250E D317K T319G S329Y zeigte ebenfalls lichtinduzierbare Adenylatzyklaseaktivität, die ca. 0,3% der Aktivität der Wildtyp-PACalpha entsprach. Die Guanylatzyklaseaktivität dieser Mutante war ca. dreifach höher als deren Adenylatzyklaseaktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass sich durch die Mutation weniger einzelner Aminosäuren die Substratspezifität von PAC von ATP nach GTP verschieben lässt. / The photoactivated adenylyl cyclase PAC is involved in phototaxis in E. gracilis. It consists of two subunits of different size which are called PACalpha and PACbeta. Both of them harbour two FAD-binding domains (F1, F2) and two cyclase domains (C1, C2). PAC and mutants of PAC have been heterologously expressed in Oocytes of Xenopus laevis. Already in darkness PAC shows a basal level of adenylyl cyclase activity, which can be increased by illumination. The increase in cyclase activity occurs with a time constant lower than 100 ms, whereas the decrease after illumination has a time constant around 10 ms. The dimer of two cyclase domains, which is necessary for catalytic conversion in all class III cyclases, is formed of C1 and C2 in PAC. In electrophysiological experiments with PAC mutants which were defective in either of the cyclase domains it has been shown, that this dimer in PACalpha occurs intermolecularly. Furthermore it has been shown, that this dimer can occur between PACalpha and PACbeta. Mutants of PACalpha where the cyclase domains have been substituted by the cyclase domains of the guanylyl cyclases GCY35 and GCY36 from C. elegans lost their ability to produce cAMP. However coexpression experiments with PAC knockout mutants indicated correct translation of the substitution mutants. Expression of fusion proteins of PACalpha with the CNG channels CNGA2 and OLF showed less light-inducable conductance changes than the expression of the single protein. In both the N-terminal and C-terminal fusion of the channel to PACalpha it was the channel which was the most affected part of the fusion protein. Deletion of the C-terminus of PACalpha results in a non-functional protein, which in coexpression with PACalpha knockout mutants shows no measurable cyclase activity. When deleting the F2-domain, PACalpha also loses its cyclase activity completely. However, the C1-domain was transcribed correctly, which could be shown by coexpression with a C1-knockout mutant. Both PACalpha-PACbeta chimeras showed adenylyl cyclase activity. Whereas the activity in the chimera with the C-terminal part of PACbeta showed little cyclase activity, the chimera possessing the C-terminal part of PACalpha showed adenylyl cyclase acitvity, which was comparable to the wildtype of PACalpha. This indicates that the part of PAC which is responsible for the difference in cyclase activity between PACalpha and PACbeta must be present in the C-terminal half of PAC. For altering PAC’s substrate specificity it was necessary to mutate at least three amino acids. The single and double mutants of PACalpha which were generated resulted in wildtypelike behaviour or reduced adenylyl cyclase activity. The triple mutant PACalpha K250E T319G S329Y showed guanylyl cyclase activity which was lower than its remaining adenylyl cyclase activity. The quadruple mutant PACalpha K250E D317K T319G S329Y also showed adenylyl cyclase activity, which was about 0.3% of the activity in PACalpha wildtype. The guanylyl cyclase activity of this mutant was about threefold higher than its adenylyl cyclase activity. Thus, it could be shown, that by mutating few single amino acids the substrate specificity of PACalpha was shifted from ATP to GTP.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:4824 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Looser, Jens |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de/doku/lic_ohne_pod.php, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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