Mediante el inmunorrastreo de una genoteca de expresión de Candida albicans con un anticuerpo policlonal específico de la forma micelial de dicho hongo (PAb anti-gt), se ha aislado un nuevo gen de este microorganismo. La represión del gen aislado ocasionó un severo defecto en la morfogénesis de C. albicans, caracterizado por la formación de cadenas de levaduras, de tamaño decreciente en dirección al extremo apical de la cadena, por lo que el gen fue denominado ABG1 (del inglés, "altered budding growth"), en base al fenotipo de crecimiento por gemación alterado observado en las cepas mutantes para dicho gen. La secuencia de aminoácidos de Abg1p, el producto del gen ABG1, presentó los porcentajes de identidad más significativos con un hipotético marco abierto de lectura existente en otro hongo levaduriforme, Saccharomyces cerevisiae, denominado YGR106c. Ensayos de inmunotransferencia (Western immunoblotting) de fracciones subcelulares con un anticuerpo policlonal frente a Abg1p, y posteriores estudios de fusión con la proteína verde fluorescente (GFP) de Aequorea victoria, revelaron que Abg1p se localizaba en la membrana vacuolar de C. albicans. El patrón de fluorescencia debido a la proteína de fusión Abg1p-GFP colocalizó con el observado tras la tinción con FM4-64, agente fluorescente que tiñe selectivamente la membrana vacuolar y la de las vesículas endocíticas. Con la finalidad de establecer el papel de ABG1 en la biología de C. albicans se procedió a la construcción de un mutante condicional, en el que la primera copia de ABG1 estaba interrumpida con el cassette URA-blaster y la segunda copia quedaba situada bajo el control del promotor de MET3. Al reprimir la expresión de ABG1, lo que se consigue por la acción represora de la metionina y cisteína sobre el promotor de MET3, el mutante fue incapaz de crecer, lo que estableció el carácter esencial de ABG1 para C. albicans. Consecuentemente con la localización subcelular de Abg1p, el análisis fenotípico del mutante condicional reveló anomalías en la morfología, tamaño y número de las vacuolas presentes en las células. La represión de ABG1 en C. albicans ocasionó, además, defectos en la división celular. En células levaduriformes estos defectos consistieron en alteraciones en el proceso de citocinesis, mientras que en las células miceliales se detectó un aumento de la frecuencia de división, manifestado como un mayor número de ramificaciones en las hifas. También se detectó un incremento en la sensibilidad de la cepa mutante a agentes antifúngicos de la familia de los azoles. Ello podría indicar una alteración en uno de los mecanismos de resistencia a estas drogas, tales como las bombas de flujo, algunas de las cuales se ha descrito que están localizadas en la membrana vacuolar. La búsqueda de proteínas que interaccionan in vivo con Abg1p mediante una técnica de marcaje con Proteína A, puso de manifiesto la posible interacción de Abg1p con una aminopeptidasa (Ape2p) y una proteína de la familia de las proteínas de estrés térmico (Ssa1p). A partir de estas observaciones se puede sugerir un modelo de función para Abg1p en la membrana vacuolar de C. albicans, en el que el producto del gen ABG1 actuaría como receptor de Ape2p, que sería transportada del citosol a la membrana vacuolar mediante su interacción con Ssa1p. En este trabajo se presenta por primera vez, evidencia de la existencia de un producto génico, Abg1p, que interrelaciona la biología vacuolar con la morfogénesis celular y la progresión del ciclo celular, procesos todos ellos asociados con la virulencia de C. albicans. Además, Abg1p es la primera proteína vacuolar esencial descrita en este hongo, y no tiene homólogos en células de mamíferos, por lo que representa una diana potencial para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. / The immunoscreening of a cDNA library with a polyclonal germ-tube specific antibody of Candida albicans led to the isolation of a novel gene of C. albicans. The repression of this gene led to the formation of bud chains that decreased in size towards the chain end. On the basis of this altered budding growth the gene was designated ABG1. Western immunoblotting of cellular fractions with a polyclonal antibody immunospecific of Abg1p and experiments of fussion with the GFP of Aequorea victoria that Abg1p was located at the vacuolar and endocytic vesicles membranes of C. albicans. In order to establish the role of ABG1 in the biology of C. albicans construction of a conditional strain for ABG1 under MET3 promoter control was achieved. Thus enabled us to demonstrate that this novel gene is essential for C. albicans. Accordingly with the subcelular localization of Abg1p, phenotypic analysis of the conditional mutant strain revealed alterations in the number, morphology and size of vacuoles. ABG1 repression also resulted in defects in cell division, characterized by a failure in the cytokinesis that lead to the formation of bud chains in yeast cells. When hyphal growth was induced an increased frequency of branching was detected. Loss of ABG1 function also resulted in pleiotropic effects on structure and/or composition of the cell wall. Search of proteins that could be interacting in vivo with Abg1p revealed the possible interaction between Abg1p and one aminopeptidase (Ape2p) and one protein of the heat shock protein (Ssa1p). Thus could suggest a function model for Abg1p in the vacuolar membrane of C. albicans, in which the product of the ABG1 gene would act as the receptor of Ape2p, which would be transported by Ssa1p from the cytosol to the vacuolar membrane. The gene product of ABG1 links vacuolar biology with cellular morphogenesis and cell cycle progression. All of these processes are associated with virulence traits in C. albicans. In addition, Abg1p is the first essential vacuolar protein described in C. albicans and has no homology with mammalian genes, suggesting that this gene product could be regarded as a potential target for antifungal chemoterapy.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/10105 |
| Date | 14 July 2005 |
| Creators | Veses Jiménez, Verónica |
| Contributors | Casanova Monroig, Manuel, Martínez García, José Pedro, Universitat de València. Departament de Microbiologia i Ecologia |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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