O recente desenvolvimento de técnicas proteômicas tem permitido a análise do perfil proteico completo dos sistemas biológicos, permitindo um melhor entendimento da fisiologia normal do organismo, bem como dos mecanismos de doenças, descoberta de biomarcadores para detecção precoce de doenças, identificação de novas terapias e descobertas de fármacos. No presente trabalho, a análise proteômica foi usada para auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na intoxicação induzida pelo fluoretono fígado de ratos e definir biomarcadores potenciais de toxicidade. Três grupos de ratos Wistar machos recém-desmamados (21 dias de vida) foram tratados ad libitum com água de beber contendo 0 (controle), 5 ou 50 mg/L de fluoreto, por 60 dias (n=6/grupo). Os animais foram eutanasiados e o fígado e o soro foram coletados. O fígado foi dividido em lobos, sendo que o esquerdo foi destinado à dosagem de fluoreto (eletrodo íon-sensível, após difusão facilitada por hexametildisiloxano), o direito à análise histológica (hematoxilina e eosina) e o mediano, à análise proteômica (eletroforese bidimensional associada a LC-MS/MS). Os dados foram analisados por ANOVA e teste de Tukey (p<0,05). Foi possível detectar uma dose-resposta em relação à ingestão para os níveis de fluoreto presentes no soro e no fígado houve diferença significativa entre os grupos que receberam 5 e 50 mg/L de fluoreto. A análise morfométrica histológica não revelou alterações nas estruturas celulares e exame o morfológico indicou inclusões lipídicas nos grupos 5 mg/L e 50 mg/L de fluoreto, mais intensas no último. A análise quantitativa de intensidade (software ImageMaster 2D-Platinum v 7.0), comparando a porcentagem de alteração de volume do spot protéico, revelou que 33, 44 e 29 spots aumentaram ou diminuíram sua expressão nos grupos controle X 5 mg/L, controle X 50 mg/L e 5 mg/L X 50 mg/L de fluoreto, respectivamente. Além disto, foram encontradas 18, 1 e 5 spots exclusivos nos grupos controle, 5 mg/L e 50 mg/L de fluoreto, respectivamente. Dentre os spots proteínas com expressão diferencial, foram identificadas 94 proteínas (72,3%). Em síntese, a exposição ao fluoreto alterou a expressão a nível hepático de proteínas pertencentes a todas as categorias funcionais, com predominância daquelas relacionadas ao metabolismo, sendo que as alterações mais pronunciadas foram observadas no grupo de 50 mg/L de fluoreto. Proteínas que tiveram sua expressão ausente mediante exposição ao fluoreto ou que tiveram sua expressão induzida por este elemento são potenciais biomarcadores para este tipo de exposição e devem ser melhor investigadas. Uma vez que se trata do primeiro trabalho envolvendo análise proteômica de fígado de animais expostos a diferentes doses de fluoreto, estes achados apontam importantes vias e processos celulares afetados no fígado pela exposição ao fluoreto, os quais devem ser melhor analisados em estudos futuros. / The recent development of proteomic techniques allowed the analysis of the whole proteomic profile of the biological systems, allowing the comprehension of the normal physiology, as well as of the mechanisms underlying diseases. It has also made easier the discovery of biomarkers of diseases, as well as the identification of new therapies and drugs. In the present study, proteomic analysis was used as a tool to help understanding the molecular mechanisms underlying chronic fluoride toxicity in rat liver and also to define potential biomarkers of toxicity. Three groups of weanling male Wistarrats (21 days) were treated ad libitum with drinking water containing 0 (control), 5 or 50 mg/L fluoride for 60 days (n=6/group). After euthanasia, liver and serum were collected. The liver was divided into lobes. The left lobe was used for fluoride analysis (ion-sensitive electrode, after hexamethyldisiloxane-facilitated diffusion). The right lobe was used for histological analysis (hematoxylin and eosine) while the median was used for proteomic analysis (2D-PAGE associated with LC-MS/MS). Data were analysed by ANOVA and Tukeys test, (p<0.05). A dose-response relationship was observed for serum fluoride levels. In liver, a significant increase in fluoride levels was observed in the 50 mg/L group when compared with the 5 mg/L group. Morphometric analysis did not reveal alterations in the cellular structures. The morphological exam revealed macrovesicular lipid droplets in the 5 and 50 mg/L groups which were more intense in the later. Quantitative intensity analysis (software ImageMaster 2D-Platinum v 7.0) comparing the percentage of alteration of volume of protein spots revealed 33, 44 and 29 protein spots that had increase or decrease in expression in the groups control X 5 mg/L, control X 50 mg/L and 5 mg/L X 50 mg/L, respectively. In addition, 18, 1 and 5 protein spots were detected exclusively in groups control, 5 mg/L and 50 mg/L, respectively. From the differentially expressed spots, 94 proteins were satisfactorily identified (72.3%). Briefly, exposure to fluoride altered the expression of liver proteins belonging to all the functional categories, especially those related to metabolism. More pronounced alterations were seen for the 50 mg/L group. Proteins that were not detected upon exposure to fluoride or that had their expression induced in the presence of fluoride are potential biomarkers of toxicity and should be better investigated. Since this is the first study involving proteomic analysis of liver in rats exposed to different doses of fluoride, these findings indicate important pathways and cellular processes affected by exposure to this element that should be addressed in details in future studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-07072011-145937 |
| Date | 24 March 2011 |
| Creators | Heloisa Aparecida Barbosa da Silva Pereira |
| Contributors | Marilia Afonso Rabelo Buzalaf, Adriana Franco Paes Leme, Camila de Oliveira Rodini Pegoraro |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Odontológicas Aplicadas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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