O objetivo deste projeto foi estudar a produção de retamicina em biorreatores de bancada por Streptomyces olindensis ICB20 em cultivos contínuos, visando avaliar a influência da freqüência de agitação (N=300, 500 ou 700rpm), da concentração de oxigênio dissolvido (OD=20, 50 ou 80%) e da velocidade específica de crescimento (µ=0,05, 0,15 ou 0,25 h-¹), segundo um planejamento fatorial completo (três fatores, N, OD e µ, em dois níveis) com seis repetições no ponto central. Os ensaios no ponto central serviram para avaliar a significância da curvatura nos modelos estatísticos e a variabilidade do processo. Buscou-se correlacionar a concentração de retamicina com estes fatores, com o diâmetro dos halos de inibição, determinados em testes de atividade biológica e com a morfologia do microrganismo, classificada em hifas, clumps ou pellets. Melhores resultados para a concentração de retamicina foram obtidos para N = 300 rpm e µ = 0,05 h-¹. A análise estatística mostrou que a concentração de oxigênio dissolvido não exerce influência sobre o processo na faixa estudada. Modelos estatísticos foram calculados, por regressão linear múltipla, para correlacionar a concentração celular, de retamicina, os fatores de conversão, a produção e as produtividades com os fatores N, OD e µ em unidades codificadas. A curvatura foi significativa (\'alfa\' = 10%) para a concentração de retamicina. Um modelo fenomenológico relacionando a concentração de retamicina à freqüência de agitação (N) e à velocidade específica de crescimento (µ) em estado estacionário foi determinado: Ret = (1005/N)*exp(-12,79*µ) R² = 0,97. Este modelo foi validado com ensaios além dos previstos no planejamento fatorial e também com os resultados obtidos por Pamboukian (2003). A correlação entre a concentração da retamicina e o diâmetro do halo de inibição (\'fi\'), determinada em testes de atividade biológica, foi: Ret = 0,2889 * \'fi\' - 1,4437 R² = 0,93 ( em mm). Com relação à morfologia, apenas a porcentagem de hifas, em relação a área total, sofreu influência de N, µ e das interações N*µ e N*OD* µ. Um modelo estatístico em unidades não codificadas foi calculado e combinado ao modelo fenomenológico. Este novo modelo considera a adição da porcentagem de clumps à de pellets, formando uma classe denominada de aglomerado (AGL): Ret = [(34 + 100*µ)/(83 - %AGL - 116* µ)] * (exp(-12,79*µ)) R² = 0,95. Foi possível correlacionar a produtividade específica de retamicina à área média dos aglomerados (AM): Pret / Xc = 0,015 * [((AM - 3,75)/AM) + exp(-0,3 * (AM - 3,75)2)] R² = 0,8. Foram testados diferentes corantes para identificar partes viáveis da célula. Apenas o corante BacLight® apresentou bons resultados, porém não foi possível concluir estes estudos por atraso no processo de importação dos filtros de fluorescência. / The aim of this project was to study the production of retamycin in bench-top bioreactors by Streptomyces olindensis ICB20 in continuous cultures in order to evaluate the influence of the agitation rate (N=300, 500 or 700 rpm), the dissolved oxygen concentration (20%, 50% or 80%) and the specific growth rate (µ=0.05, 0.15 or 0.25 h-¹). A full factorial experimental design (three factors, two levels) was used to perform these experiments, including six runs at the central point, to analyse the significance of the curvature of the statistical models and variability of the process. Models to calculate retamycin concentration in function of these factors, growth inhibition diameter, determined by disc diffusion tests and the morphology of the microrganism, grown as filaments, clumps or pellets were investigated. Best results were achieved for retamycin concentration when N = 300 rpm and µ = 0.05 h-¹. Statistical analysis showed no influence of the dissolved oxygen concentration in the range studied. Statistical models were calculated by multiple linear regression for the responses of interest (biomass, reatmycin and glucose concentration, conversion yields and productivities) in function of N, OD and µ in coded units. Curvature was significant (\'alfa\' = 10%) for retamycin concentration. A phenomenological model for retamycin concentration in function of the agitation rate (N) and specific growth rate (µ) in steady state was determined: Ret = (1005/N)*exp(-12.79*µ) R² = 0.97. This model was checked by calculation with data of all runs included in this project and also of some continuous experiments reported by Pamboukian (2003), when 0.05 µ 0.25 h-¹. A correlation between retamycin concentration as a function of the diameter of the growth inhibitory area (\'fi\') was determined (biological activity tests): Ret = 0.2889 * \'fi\' - 1.4437 R² = 0.93, ( in mm). It was not possible to establish a correlation between either clumps or pellets percentage and the factors of the experimental design. Filaments percentage was related to N, µ and the interactions N*µ and N*OD* µ. A statistical model in uncoded units was calculated and combined with the phenomenological model. In this case the percentage of clumps was added to the percentage of pellets; this morphological class was identified as AGL: Ret = [(34 + 100*µ)/(83 - %AGL - 116* µ)] * (exp(-12.79*µ)) R² = 0.95. Another model relating the specific retamycin productivity to the average area of AGL was proposed: Pret / Xc = 0,015 * [((AM - 3.75)/AM) + exp(-0,3 * (AM - 3.75)2)] R² = 0.8. Different dyes were tested to identify non-viable cells. Good results were achieved using BacLight® . Unfortunatelly it was not possible to conclude these experiments due to some delay occurred in the process to import specific fluorescense filters.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-15082008-002132 |
| Date | 16 June 2008 |
| Creators | Costa, José Paulo Castilho Lopes da |
| Contributors | Facciotti, Maria Cândida Reginato |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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