Diversos estudos têm demonstrado que os danos causados pela exposição da pele à radiação ultravioleta (RUV) são relacionados aos fotodanos ao DNA, geração de espécies reativas de oxigênio e ativação de mediadores do processo inflamatório. Há, portanto, um crescente interesse pelo uso de antioxidantes com potencial fotoquimiopreventivo, como o extrato de maçã e a rutina. O modelo mais utilizado para avaliação de agentes fotoquimiovreventivos é a exposição de camundongos sem pelos à RUV. Porém, os esforços para diminuir ou mesmo evitar a utilização de animais em ensaios científicos tem levado a busca por métodos alternativos à experimentação animal. Na primeira etapa desse trabalho visou-se a otimização de parâmetros relativos ao processo de extração do pó da maçã, bem como a caracterização do extrato obtido e da rutina. Assim, as condições de extração da maçã otimizadas foram tempo de extração de 22 h, teor de etanol no solvente de 60 % (p/p) e proporção solvente:planta de 18 (p/p). A concentração dos ativos presentes na maçã levou ao extrato enriquecido com polifenóis da maçã (EEPM), que apresentou elevada atividade antioxidante in vitro e teor de rutina de 6,1 ± 0.3 ?g/g de extrato. Ambos os ativos apresentaram baixa ou nenhuma toxicidade contra os fibroblastos MRC5, bem como protegeram os fibroblatos contra a morte induzida pela RUV e inibiram a formação de peróxidos lipídicos gerados pelas células irradiadas no tratamento com 4000 e 100 ?g/mL de EEPM e rutina, respectivamente. Na segunda etapa desse trabalho visou-se a avaliação do potencial fotoquimiopreventivo do EEPM e da rutina adicionados a uma formulação tópica em modelos de biópsia de pele humana e pele humana reconstruída in vitro e de camundongo sem pelos in vivo. O EEPM (1,25 %) e a rutina (0,75 %) em formulação foram avaliados quanto à retenção cutânea in vitro utilizando célula de difusão vertical de Franz e, embora não tenha sido possível detectar compostos do EEPM, foi demonstrado que 2,04 ± 0,19 ?g/cm2 da rutina ficou retida na biópsia de pele humana. Na avaliação da eficácia fotoquimiopreventiva em modelos de pele humana in vitro o EEPM e a rutina adicionados em formulação foram capazes de evitar/diminuir a formação de sunburn cells, a indução de caspase-3, dímeros de ciclobutanodipirimidina, metaloproteinases e peroxidação lipídica em pele exposta à RUV. Quanto a atividade funcional in vivo, o extrato enriquecido com polifenóis da maçã apresentou leve efeito inibidor do infiltrado inflamatório induzido pela RUV, enquanto que tanto a rutina como o extrato inibiram a depleção dos níveis de GSH endógeno, o que sugere uma potente atividade fotoquimiopreventiva para estes princípios ativos. Estes resultados são promissores e apontam para o uso do EEPM e da rutina na prevenção/tratamento dos danos induzidos pela RUV na pele. / Several studies have shown that the ultraviolet radiation (UVR) - induced skin damage are related to DNA photolesions, generation of reactive oxygen species and activation of inflammatory mediators. Therefore, there is an increasing interest in the use of antioxidants with photochemoprotective potential, such as apple extract and rutin. The most used model for evaluation of photochemoprotective agents is the exposure of hairless mice to UVR. However, efforts to reduce or even avoid the use of animals in scientific trials has pursued for alternative methods to replace/reduce animal testing. The first step of this work aimed to optimize parameters for the extraction of apple powder and the characterization of the obtained extract and rutin. Thus, the optimized apple extraction conditions were extraction time of 22 h, ethanol content of 60% (w/w) and plant:solvent ratio of 18 (w/w). The apple extract concentration led to an enriched apple polyphenols extract (EEPM), which showed strong in vitro antioxidant activity and rutin content of 6.1 ± 0.3 ?g / g. The actives showed low or no toxicity against MRC5 fibroblasts, protected these cells against UVR - induced death and inhibited lipid peroxidation in irradiated cells (treatment with 4000 and 100 ?g/mL of EEPM and rutin, respectively). The second step of this study aimed to evaluate the photochemoprotective potential of EEPM and rutin added in a topical formulation and assayed in in vitro models of human skin biopsy and human reconstructed skin and in vivo hairless mouse. The EEPM (1.25%) and rutin (0.75%) formulations were evaluated for skin retention in vitro using the Franz diffusion cell and, although it was not possible to detect compounds of EEPM, rutin was retained in the human skin biopsy (2.04 ± 0.19 mg/cm2). As regard the The photochemoprotective efficacy in in vitro models of human skin, EEPM and rutin formulations were able to prevent/reduce the formation of sunburn cells, induction of caspase-3, cyclobutane pyrimidine dimers, matrix metalloproteinases and lipid peroxidation in skin exposed to UVR. As for in vivo functional activity, EEPM showed a slight inhibitory effect of UVR-induced inflammatory infiltrate, while both EEPM and rutin completely inhibited endogenous GSH levels depletion. These results are promising and suggest the use of EEPM and rutin in the prevention/treatment of ultraviolet radiationinduced damage to the skin.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-17042015-151957 |
| Date | 24 October 2014 |
| Creators | Siqueira, Silvia de |
| Contributors | Fonseca, Maria Jose Vieira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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