La fibrosis quística (fq) es la enfermedad autosómica recesiva más frecuente en la población caucasoide con una frecuencia de portadores de 1/25. Las manifestaciones clínicas más importantes son las infecciones crónicas recurrentes del pulmón conllevando al deterioro del mismo. En esta tesis nos propusimos corregir dos mutaciones en el gen cftr, responsable de la fq, en la linea celular de epitelio bronquial ib3.1 de genotipo (f508del/w1282x). Para ello, mediante citometría de flujo y microscopía confocal pusimos a punto la incorporación no viral (vectores pei, geneporter y citofectina) de oligonucleótidos modificados (quimeraplastos y oligonucleótidos fosforotioato) y de fragmentos sfhr en estas células. Los quimeraplastos son oligonucléotidos quiméricos de rna y dna y los oligonucleótidos fosforotioato contienen enlaces fosforotioato para evitar su degradación además de enlaces fosfodiéster. Ambos, son capaces de estimular los mecanismos de reparación intrínsecos de las células para corregir a nivel de dna mutaciones puntuales. Los fragmentos sfhr (small fragment homologous replacement) son fragmentos de pcr de longitud variable con la secuencia salvaje del gen que se intercambian con las secuencias genómicas diana mutadas por recombinación homóloga para revertir mutaciones puntuales (cambios de 1 nucleótido, pequeñas inserciones o deleciones). Para estimar el porcentaje de corrección génica adaptamos la técnica diagnóstica de pcr-ola a nuestro modelo para utilizarla como metodología de cuantificación. Además, hemos confirmado que las células ib3.1 tienen los mecanismos de reparación de mutaciones puntuales activos tanto por rt-pcr como por un ensayo in vitro en e.coli con el plásmido pksm4021 que contiene el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a kanamicina inactivado por una mutación puntual. Los resultados que se publicaron en los siguientes artículos nos han permitido extraer las siguientes conclusiones: las células Ib3.1 de epitelio bronquial de fq son competentes en cuanto al sistema de reparación mmr. La incorporación celular de quimeraplastos, oligonucleótidos monocadena y fragmentos sfhr es muy eficiente en las células ib3.1. El lípido catiónico citofectina, el policatión pei y la electroporación, aunque no el lípido catiónico geneporter, son sistemas de transfección eficientes para incorporar oligonucleótidos modificados en el núcleo de las células ib3.1. Los poliplejos de pei y los lipoplejos de citofectina son internalizados por distintos mecanismos aunque en ambos casos los oligonucleótidos modificados son degradados significativamente en las células ib3.1. El análisis genescan de electroferogramas fluorescentes constituye un sistema fiable, fácil, sensible y seguro para evaluar y cuantificar la degradación intracelular y extracelular de oligonucleótidos marcados con fluorescencia en fluidos biológicos. La tecnología de pcr-ola constituye un sistema fiable y preciso de cuantificación de reparación génica aplicable a modelos celulares heterocigotos. Los fragmentos sfhr pueden actuar como cebador artefactual en las reacciones de pcr y generar un artefacto que da lugar a falsos positivos en la detección de conversión génica. Es indispensable diseñar los cebadores de detección de la modificación génica fuera de la región de homología con los fragmentos sfhr. La corrección génica de mutaciones puntuales mediada por quimeraplastos, oligonucleótidos monocadena y fragmentos sfhr es un proceso ineficiente en las células ib3.1. Será necesario estimular los mecanismos endógenos de reparación génica para incrementar la frecuencia de reparación génica hasta niveles terapéuticos en dichas células.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UPF/oai:www.tdx.cat:10803/7084 |
| Date | 11 February 2005 |
| Creators | Semir Frappart, David de |
| Contributors | Aran Perramon, Josep Mª, Universitat Pompeu Fabra. Departament de Ciències Experimentals i de la Salut |
| Publisher | Universitat Pompeu Fabra |
| Source Sets | Universitat Pompeu Fabra |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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