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Previous issue date: 2016-02-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peripheral nerve injury disrupts the normal functions of neurons and leads to rapid and
progressive alterations in structural skeletal muscle, such as muscle atrophy and fibrosis,
causing functional deficits. Electrical stimulation (ES) has been recommended to treat
denervated muscles. The best parameters of ES to minimize muscle atrophy due to
denervation is controversial. Furthermore, it is not clear if ES can, in fact, affect reinnervation
of denervated muscles. Thus, this thesis has two main objectives: 1) to verify if ES, applied
to denervated muscles by surface electrodes, can affect neuromuscular recovery after nerve
crush injury in rats; and 2) to assess the impact of ES on fibrosis establishment in denervated
muscles. Two manuscripts were produced and used the same experimental groups. Thirtyfive
Wistar rats were divided into 5 groups: (1) Normal (N); (2) 7-day denervation (D7d); (3)
7-day denervation and ES (DES7d); (4) 15-day denervation (D15d); and (5) 15-day
denervation and ES (DES15d). Tibialis anterior (TA) muscle denervation was induced by
crushing the sciatic nerve. The ES protocol to stimulate TA muscles consisted of: 200
contractions per day divided into 4 consecutive series of 50 contractions, with 10-minute rests
between each set. The following parameters were used: exponential monophasic pulse; width
time: 2x chronaxie; amplitude: motor level; time On: 3s and Off: 6s. The sciatic functional
index was calculated. Muscle excitability was assessed considering the rheobasis, chonaxie
and accommodation. Morphometric analyses, such as the muscle fiber cross-sectional area
and percentage of connective tissue proliferation were used to characterize muscle
morphology. Molecular markers related to reinnervation (neural cell adhesion molecule, NCAM),
neuromuscular junction organization and maintenance (MuSK, Dok-7 and nicotinic
Acetylcholine Receptors (nAChR) subunits), muscle mass control (atrogin-1, MuRF1, myoD
and myostatin), fibrosis (TGF-β and myostatin), extracellular matrix remodeling
(metaloproteinases, MMPs) and inflammation (TWEAK/Fn14) were investigated by
molecular biology techniques such as western-blot, qPCR or zymography. The main results
showed ES impaired natural recovery of denervated muscles accentuating disability, muscle
atrophy and fibrosis, as well as reducing muscle excitability. These morphofunctional and
electrophysiological changes were related to different modulations of all molecular markers
investigated in a timely manner. Overall, this thesis provides evidence that ES can delay the
reinnervation process by modulating factors related to NMJ stability and organization, as well
as induced disability and muscle atrophy, and decreased muscle excitability. In addition, ES
applied to denervated muscles induced muscle fibrosis by modulating inflammatory pathways
and also extracellular matrix production and remodeling. Warnings should be given to
rehabilitation teams when recommending ES to treat denervated muscles. / A lesão nervosa periférica interrompe as funções normais dos neurônios e leva a alterações
rápidas e progressivas no músculo esquelético, tais como a atrofia muscular e a fibrose,
causando perdas funcionais. Para o tratamento dos músculos desnervados a estimulação
elétrica (EE) tem sido utilizada. A escolha dos melhores parâmetros de EE para minimizar a
atrofia muscular devido a desnervação, é controversa. Além disso, não está claro se a EE
pode afetar, de fato, a reinervação de músculos desnervados. Assim, esta tese tem dois
objetivos principais: 1) verificar se a EE, aplicada aos músculos desnervados com eletrodos
de superfície, pode afetar a recuperação neuromuscular após axonotmese do nervo ciático em
ratos; e 2) avaliar o impacto da EE no estabelecimento da fibrose do músculo desnervado.
Dois manuscritos foram produzidos e contavam com os mesmos grupos experimentais. Trinta
e cinco ratos Wistar foram divididos em 5 grupos: (1) Normal (N); (2) Desnervado 7 dias
(D7d); (3) Desnervado e ES 7 (DES7d); (4) Desnervado 15 dias (D15d); e (5) Desnervado e
ES 15 dias (DES15d). Foi realizada a axonotmese no nervo isquiático. O protocolo de EE do
músculo tibial anterior consistiu em: 200 contrações por dia, divididas em 4 séries
consecutivas de 50 contrações, com 10 minutos de descanso entre cada série. Foram
utilizados os seguintes parâmetros: pulso monofásico exponencial; tempo: 2 vezes cronaxia;
amplitude: nível motor; TON: 3s e TOFF: 6s. O índice funcional do ciático foi calculado. A
excitabilidade muscular foi avaliada considerando a reobase, cronaxia e acomodação.
Análises morfométricas, tais como área de secção transversa da fibra muscular e a
porcentagem de proliferação do tecido conjuntivo foram utilizados para caracterizar a
morfologia. Marcadores moleculares relacionados à reinervação como a N-CAM (molécula
de adesão celular neural), organização e manutenção da junção neuromuscular (JNM)
(MuSK, Dok-7 e receptores de acetilcolina), controle de massa muscular (atrogin-1, MuRF1,
myoD e miostatina), fibrose (TGF-β e miostatina), remodelação da matriz extracelular
(metaloproteinases) e, inflamação (TWEAK / Fn14) foram investigados por técnicas de
biologia molecular como western-blot, qPCR ou zimografia. Os principais resultados
mostraram que a EE provocou perda da recuperação natural dos músculos desnervados
acentuando a perda funcional, a atrofia muscular e a fibrose, assim como, reduzindo a
excitabilidade muscular. Estas alterações morfofuncionais e eletrofisiológicas foram
relacionadas à diferentes modulações de todos os marcadores moleculares, no decorrer do
tempo estudado. De modo geral, a presente tese forneceu provas de que a EE pode atrasar o
processo de reinervação por fatores relacionados com a estabilidade e a organização da JNM,
bem como a induzir à incapacidade e à atrofia muscular, com diminuição da excitabilidade
muscular. Além disso, a EE aplicada aos músculos desnervados induziu fibrose através da
modulação da via inflamatória e também pela produção e remodelamento da matriz
extracelular. Cuidados devem ser tomadas pelas equipes de reabilitação ao utilizar a EE no
tratamento de músculos desnervados.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/8506 |
| Date | 26 February 2016 |
| Creators | Pinheiro, Clara Maria |
| Contributors | Russo, Thiago Luiz de |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Fisioterapia, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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