[pt] Durante as últimas décadas tem-se acentuado o desenvolvimento de técnicas de
fluorescência e suas aplicações em biociências e biotecnologia. Dada sua alta
sensibilidade de detecção, tais técnicas têm-se tornado ferramentas importantes em muitas
áreas de pesquisa tais como diagnósticos médicos, análise genética, mapeamento
estrutural de células, estudos de fármacos, caracterização de complexos de fármacos com
metais, análise da interação de fármacos com proteínas, lipídeos e DNA. Os anestésicos
locais são fármacos que bloqueiam reversivelmente a condução nervosa quando aplicados
a uma região circunscrita do corpo. Entretanto, possuem uma variedade de efeitos nos
sistemas biológicos que não somente os efeitos de anestesia. Os antibióticos
fluorquinolonas são agentes antimicrobianos sintéticos utilizados clinicamente há mais de
30 anos. Além de sua atividade antibacteriana, algumas fluorquinolonas vêm sendo
aplicadas no desenvolvimento de drogas anticancerígenas e anti-HIV. O pH local de
muitos meios biológicos tem grande influência nas propriedades espectroscópicas de
muitos fármacos. Suas constantes de ionização, pKa, podem ser obtidas
experimentalmente através de medidas espectroscópicas tais como absorbância,
intensidade de fluorescência e parâmetros da fluorescência resolvida no tempo. Neste
trabalho estudamos a partir da técnica de fluorescência estacionária e fluorescência
resolvida no tempo os anestésicos locais dibucaína e tetracaína. Estudamos também os
antibióticos norfloxacina e levofloxacina e seus respectivos complexos com ouro.
Determinamos os tempos de vida de fluorescência e descrevemos ainda como as
propriedades espectrais de fluorescência que se alteram em função do pH. Nos estudos de
decaimento da fluorescência, desenvolvemos expressões para os fatores pré-exponenciais
e as intensidades fracionárias de fluorescência como função do pH para amostras
fluorescentes que sofrem transição ácido-base. Mostramos que os valores de pKa são
aparentemente deslocados e obtivemos as expressões para o deslocamento.
Determinamos as constantes de ionização, pKa, a partir da fluorescência estacionária e de
parâmetros associados aos tempos de vida e testamos as expressões teóricas nos
resultados experimentais. Os valores obtidos foram coerentes para as constantes de
ionização dos fármacos dibucaína, levofloxacina e norfloxacina. Acredita-se que a ação
dos anestésicos locais deve-se à interação das moléculas do anestésico com lipídeos e/ou
proteínas de membrana. Uma análise desta interação mostra-se necessária para se
investigar a difusão do anestésico na membrana e seu efeito na organização e dinâmica
dos lipídeos e proteínas que constituem a membrana. Investigamos a interação da
dibucaína e tetracaína com membranas enriquecidas em Na,K-ATPase e a incorporação
do fármaco à membrana. Determinamos as constantes de associação. O valor obtido para
a dibucaína foi de 0.91 × 10(3) M(-1) e para a tetracaína 0.77 × 10(3) M(-1). Estudamos a
acessibilidade dos triptofanos por supressão de fluorescência do triptofano pela dibucaína,
obtivemos uma acessibilidade de 90% para os triptofanos e uma constante de supressão
dinâmica de 4.3 × 10(4) M(-1). / [en] During the last decades the development of fluorescence techniques and their
applications in bioscience and biotechnology has been accentuated. Due to high
sensitivity, such techniques have become important tools in many research areas such as
medical diagnosis, genetic analysis, structural mapping of cells, drug investigation,
characterization of drug-metal complexes, analysis of drugs interaction with proteins,
lipids and DNA. The local anesthetics are drugs that reversibly block the nervous impulse
when applied to a limited region of the body. However, they possess a variety of
additional effects in the biological systems. The fluoroquinolone derived antibiotics are
synthetic antimicrobial agents that have been used clinically for more than 30 years. In
addition to their antibacterial activity, some fluoroquinolones have been applied in the
development of anticancer drugs and anti-HIV. The local pH of many biological
environments has great influence in the spectroscopic properties of many drugs, including
local anesthetics and fluoroquinolones. The ionization constants of the drugs, pKa, can be
experimentally obtained via spectroscopic parameters such as absorbance, fluorescence
intensity, and time-resolved fluorescence parameters. In this work we studied the local
anesthetics dibucaine and tetracaine using steady state and time resolved fluorescence
techniques. We also studied the antibiotics norfloxacin and levofloxacin and their
complexes with gold. We determined the fluorescence lifetimes and described how the
spectral fluorescence properties alter as a function of the pH. In the studies of
fluorescence decay, we developed expressions for the pre-exponential factors and the
fractional fluorescence intensities as a function of the pH for a fluorophore undergoing an
acid-base transition. We showed that the pKa values are apparently shifted and obtained
the expressions for the pK shifts. We determined the ionization constants, pKa from
steady state fluorescence and from parameters associated with the lifetimes, and we tested
the theoretical expressions using the experimental results. The observed pK shifts for
dibucaine, levofloxacin and norfloxacin were found to agree with the theoretical
expressions. The action of local anesthetics is believed to involve the interaction of the
anesthetic molecules with lipids and/or membrane proteins. An analysis of this interaction
is necessary to examine the anesthetic diffusion in the membrane and its effect in the
organization and dynamics of the membrane lipids and proteins. We investigated the
interaction of dibucaine with Na,K-ATPase enriched membranes, and the incorporation
of the drug in the membrane. We determined the binding constants. The obtained values
were 0.91 × 10(3) M(-1) for dibucaine and 0.77 × 10(3) M(-1) for tetracaine. We also studied the
accessibility of the tryptophan residues using the fluorescence quenching by dibucaine.
We obtained a dynamic quenching constant of 4.3 × 10(4) M(-1).
Identifer | oai:union.ndltd.org:puc-rio.br/oai:MAXWELL.puc-rio.br:15676 |
Date | 28 May 2010 |
Creators | FABRICIO CASAREJOS LOPES LUIZ |
Contributors | SONIA RENAUX WANDERLEY LOURO |
Publisher | MAXWELL |
Source Sets | PUC Rio |
Language | Portuguese |
Detected Language | English |
Type | TEXTO |
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