The stabilization, immobilization and biocatalysis of hydroperoxide lyase (HPL) of the enzymatic extract, from Penicillium camemberti, in neat organic solvent media (NOSM) were investigated. The effects of lyoprotectants, KCl and dextran 1 kDa, on HPL activity and its stability were studied. The addition of KCl to the HPL enzymatic protein 70:1 (w/w), prior to its lyophilization, enhanced its activity by 6.53-fold, whereas the use of dextran resulted in its inactivation. The thermostability of HPL activity of the enzymatic extract at 80°C, in the presence of KCl, was higher by 2.78-fold than that without it. Selected chemical additives, glycine and 2-mercaptoethanol, as well as surfactant coated-enzyme (SCE) were also employed to increase the catalytic activity and stability of HPL enzymatic extract. The presence of 7% glycine or 2.5% of 2-mercaptoethanol in hexane reaction medium increased the HPL activity by 1.76- and 1.22-fold, respectively, as compared to that without additive. The modification of the enzymatic extract by its coating with Span 65, at a surfactant to protein ratio of 1:1 (w/w), resulted in 2.57-fold increase in HPL activity. The presence of 7.0% glycine or 2.5% of 2-mercaptoethnol resulted also by a higher HPL thermostability, with 3.8- and 3.5-fold, respectively, as compared to that without additive; however, the decrease in HPL thermostability was obtained with Span 65 coated-enzyme. The HPL enzymatic extract was encapsulated within alginate and hydrophobically modified alginate hydrogel, using reverse micellar system (RMS) and ternary micellar system (TMS). The dehydration, with 2-propanol, of the encapsulated enzymatic extract increased the HPL specific activity by 1.83-fold as compared to that without dehydration. Using hexane as the reaction medium, the encapsulated HPL extract in 2.0% (w/v) alginate (Alg) resulted by a 52.5% encapsulation yield and 1.37-fold higher enzyme activity than that of the free one. With ratio of 2.5 alginate to 1 of either RMS or TMS, the partition coefficient of 10-HPOD was 2.40- and 1.67-fold, respectively, higher than that of alginate alone. The HPL activity of the enzymatic extract, encapsulated in Alg:TMS (2.5:1), was enhanced by 1.42-fold, as compared to that with alginate alone; however, the inactivation of HPL activity was obtained with Alg:RMS (2.5:1). The immobilization of HPL enzymatic extract, using selected supports, and its biocatalysis in NOSM were also investigated. Dowex®50WX4-200 was found to be the most appropriated support, with an increase in HPL activity by 2.66-fold as compared to that of the free one; however, an inactivation of HPL activity was obtained with the use of Eupergit®C250L-IDA, Eupergit®C250L-EDA and Silica as supports. The chemical modification of HPL enzymatic extract with succinic anhydride, at a molar ratio of 10:1 of succinic anhydride to lysine, increased the immobilization yield by 2.21-fold, as compared to that of the untreated one. The chemical modification of HPL enzymatic extract by 14.37 to 54.98% enhanced the enzyme activity of the immobilized one by 4.28- and 3.31-fold, respectively. On the other hand, the highest HPL enzyme activity in hexane reaction medium of the free and the Dowex immobilized enzyme extracts was obtained with an initial water activity (aw) of 0.10 and 0.33, respectively. In addition, the optimum reaction temperature for the HPL activity was determined to be 55 and 45°C for the free and immobilized enzymatic extract, respectively. / La stabilisation, l'immobilisation et la biocatalyse en milieux des solvants organiques (OSM) de l'extrait enzymatique de l'hydroperoxide lyase (HPL), obtenu à partie de Penicillium camemberti, ont été étudiés. Les effets des lyoprotecteurs tels que le KCl et le dextrane 1 kDa sur l'activité et la stabilité de l'HPL ont aussi été étudiés. Bien que l'activité de l'HPL a été 6,53 fois plus élevée que celle après l'ajout de KCl à la protéine enzymatique avant sa lyophilisation dans une proportion de 70 à 1 (p/p); l'ajout de la dextrine a rendu l'enzyme inactive. De plus, la stabilité thermique à 80°C de l'activité de l'HPL de l'extrait enzymatique en présence de KCl est 2,78 fois plus élevée. Des additifs chimiques sélectionnés tels que la glycine et le 2-mercaptoéthanol ainsi que des surfactants enrobant l'enzyme ont aussi été utilisées pour augmenter l'activité catalytique et la stabilité de l'HPL. L'activité de l'HPL en milieu réactionnel de l'hexane a été 1,76 et 1,22 plus élevée en présence, respectivement, de 7% de la glycine ou du 2.5% de 2-mercaptoéthanol. L'activité de l'HPL a augmentée de 2,57 fois lorsque l'extrait enzymatique a été enrobé par le Span 65 dans une proportion du surfactant à protéine de 1:1 (p/p). La stabilité thermique de l'HPL est 3,8 et 3,5 fois plus élevée en présence de 7% de la glycine et du 2.5% de 2-mercaptoéthanol, respectivement. Cependant, la stabilité thermique de l'HPL a diminué quand l'extrait enzymatique été enrobé par le Span 65. De plus, l'extrait enzymatique de l'HPL a été encapsulé dans l'alginate (Alg) et dans l'hydrogel d'alginate hydrophobiquement modifiée, en utilisant le système micellaire inversé (SMI) et le système micellaire ternaire (SMT). L'activité de l'HPL a été 1,83 fois plus élevée lorsque l'extrait enzymatique encapsulé a été déshydraté par le 2-propanol. Les résultats tendent à montrer que l'encapsulation de l'extrait enzymatique de l'HPL dans 2,0% (p/v) d'Alg a un taux d'un taux d'immobilisation de 52,5% et de1,37 fois de plus d'activité enzymatique dans l'hexane par rapport à celui non-encapsulé. En utilisant le ratio de 2,5 d'Alg à 1 SMI ou SMT, le coefficient de partage du 10-HPOD a été, respectivement, de 2,40 et de 1,67 fois plus élevé que celui réalisé dans un milieu réactionnel contenant seulement de l'Alg. L'activité de l'HPL de l'extrait enzymatique encapsulé dans un milieu réactionnel contenant Alg:TMS (2,5:1) a été 1,42 fois plus grande que celle dans celui formé seulement de l'Alg. Cependant, dans un milieu réactionnel contenant le mélange de Alg:RMS (2,5:1), l'HPL a été inactive. L'étude s'est ensuite portée sur l'immobilisation et de la biocatalyse en OSM de l'extrait enzymatique de l'HPL en utilisant des supports sélectionnés. Les résultats tendent à montrer que le Dowex®50WX4-200 a été le support le plus approprié puisque l'activité de l'HPL a été 2,66 fois plus que celle obtenue en l'absence du support. D'autre part, l'utilisation de l'Eupergit®C250L-IDA, l'Eupergit®C250L-EDA et le Silica, comme supports, a rendue l'HPL inactive. Quand l'extrait enzymatique de l'HPL a été chimiquement modifié avec une solution d'anhydride succinique et de lysine à un ratio molaire de 10:1, le taux d'immobilisation a été 2,21 fois plus grande que celui de l'extrait non-modifié. L'activité de l'HPL de l'extrait enzymatique immobilisé a été 4,28 et 3,31 fois lorsqu'il a été modifié chimiquement à 14,37 et 54,98%, respectivement. De plus, la plus grande activité enzymatique de l'HPL des extraits enzymatiques, libre et immobilisé sur le Dowex, a été obtenue en utilisant l'hexane comme le milieu réactionnel, avec une activité initiale de l'eau (aw), respectivement, de 0,10 et de 0,33. La température optimale de la réaction enzymatique de l'HPL est 55 et de 45°C pour l'extrait libre et immobilisée, respectivement.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.106486 |
| Date | January 2012 |
| Creators | Kuldamrong, Watchareeya |
| Contributors | Selim Kermasha (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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