Both intracellular and extracellular levansucrase (LS) were recovered from Bacillus amyloliquefaciens biomass. Sucrose was identified as an important inducer for the expression of LSs. Polyethylene glycol (PEG 200) selectively fractionated intracellular (vs. extracellular) LS activity. Partially purified intra- and extracellular LSs were studied in terms of their optimum reaction temperature, pH, kinetics as well as their catalytic properties. B. amyloliquefaciens LSs exhibited high levan-forming activity over a wide range of sucrose concentrations. The optimum temperatures for the intra- (25-30 °C) and extracellular (40 °C) LS transfructosylation activities were lower than those for their hydrolytic activities (45-50°C). Intracellular LS's catalytic efficiency in transfructosylation exceeded that of extracellular LS. Intracellular LS was purified to homogeneity by size-exclusion chromatography and its catalytic properties was determined. The purified LS's transfructosylic activity (kcatapp of 1136.5 s−1) exceeded its hydrolytic activity. The kinetics of LS's transfructosylation activity were best fitted to the Hill model. In LS donor specificity studies, a shift of the transfructosylation reaction further towards the polymerization was observed when raffinose was used as fructosyl donor as compared to sucrose. In fructooligosaccharide (FOS) synthesis, disaccharides were more favourable fructosyl acceptors than monosaccharides. However, a lower accumulation of levan was detected in the maltose/sucrose reaction, and a greater amount of erlose was the dominant transfructosylation product in the reaction. This study is the first to highlight the catalytic efficiency of B amyloliquefaciens LS to synthesize a variety of hetero-FOSs from various saccharides, with lactose and maltose being the best fructosyl acceptors. Purified intracellular LS was subsequently combined with fructanases from Aspergillus niger to achieve the one-step synthesis of controlled-size novel FOSs and oligolevans from sucrose. Endo-inulinase from A. niger was able to hydrolyze both low and high MW levan and thus gave rise to different MW FOSs, whilst fructanase® (endo- and exo-inulinases) hydrolyzed levans almost completely to fructose. Therefore, endo-inulinase was chosen for use in the combined bi-enzymatic reactions. In this novel biocatalytic system, LS mainly catalyzed the synthesis of oligolevan and levan, whilst endo-inulinase regulated the product molecular size and acceptor availability. The novel bi-enzymatic system showed higher yield and productivity (67% w/w; 96 g/L/h) of transfructosylation products, FOSs and oligolevans, than the LS enzymatic system (3.0% w/w; 0.8 g/L.h) alone. The contribution of endo-inulinase's hydrolytic activity to the formation of short chain FOS (scFOS) and oligolevans was greater than that of LS through its acceptor reaction; however, the production of intermediate levans with appropriate MW by LS was the prerequisite. The effects of sucrose concentration, reaction time, and enzymatic ratio on FOSs, oligolevans, and total transfructosylation products were assessed through a response surface methodology (RSM). Additional experimental runs using the novel bi-enzymatic system confirmed the RSM-predicted maximal FOS and oligolevan levels. RSM analysis showed sucrose level to be the most influential of the design variables tested, whilst the LS to endo-inulinase ratio had significant effects on levanohexaose and oligolevans formation. Given the biocatalytic system's low reaction temperatures (35 °C) and substrate concentrations (0.6 M), the novel biocatalytic system showed great potential for industrial applications, where huge cost effectiveness benefits would arise from commercial scale-up production. In addition, the short reaction time as well as high FOSs yield of the novel biocatalytic system are also superior to all current documented FOSs biocatalytic systems. / L'enzyme levansucrase intracellulaire et celle extracellulaire ont été isolées de la biomasse du Bacillus amyloliquefaciens. Le sucrose a été identifié comme un inducteur important pour l'expression de la levansucrase. Les levansucrases intra- et extracellulaire, purifiées partiellement, ont été caractérisées en termes de température optimale, pH optimal, paramètres cinétiques, et propriétés catalytiques. Les levansucrases de B. amyloliquefaciens ont démontré une activité catalytique élevée pour la formation de levan à travers une large gamme de concentrations du sucrose. Les températures optimales des activités de transfructosylation des levansucrases intracellulaire (25-30°C) et extracellulaire (40ºC) sont plus faibles que celles de leur activités hydrolytiques (45-50°C). L'efficacité catalytique de la levansucrase intracellulaire en transfructosylation a dépassé celle de la levansucrase extracellulaire. La levansucrase intracellulaire a été purifiée jusqu'à l'homogénéité par chromatographie d'exclusion stérique et ses propriétés catalytiques ont été déterminées. L'activité de transfructosylation de la levansucrase purifiée (kcatapp de 1136.5 s−1) a été plus élevée que son activité hydrolytique. Les cinétiques catalytiques de l'activité de transfructosylation ont été mieux décrites par le modèle de Hill. L'étude de la spécificité de la levansucrase a démontré une orientation de la réaction de transfructosylation vers la polymérisation quand le raffinose a été utilisé comme donneur de fructose. Durant la synthèse du fructooligosaccharides, les disaccharides ont été favorisés comme accepteurs, par rapport aux monosaccharides. Cependant, une accumulation moins importante du levan a été obtenue dans la réaction de transfructosylation utilisant maltose et sucrose comme substrats. Cette étude est la première à démontrer l'efficacité catalytique de la levansucrase de B. amyloliquefaciens pour la synthèse de divers FOS à partir de saccharides variés, dont le lactose et le maltose ont été les meilleurs substrats accepteurs de fructose. La levansucrase intracellulaire purifiée a été combinée avec l'endo-inulinase de Aspergillus niger dans une seule étape réactionnelle pour synthétiser de nouveaux FOSs et des oligolevans de tailles contrôlées à partir du sucrose. Dans ce nouveau système bi-enzymatique, la levansucrase a surtout catalysé la formation d'oligolevan et de levan, tandis que l'endo-inulinase a régulé la taille moléculaire des produits et la disponibilité des accepteurs. Le nouveau système bi-enzymatique a démontré un rendement et une productivité (67% m/m; 96 g/L/h) plus élevés des produits de transfructosylation, des FOS et des oligolevans, que le système mono-enzymatique (3.0% m/m; 0.8 g/L.h). La contribution de l'activité hydrolytique de l'endo-inulinase dans la formation des courtes chaînes de FOS et des oligolevans a été plus importante que celle de la levansucrase. Les effets de la concentration du sucrose, du temps de réaction, et du ratio enzymatique sur les rendements des FOSs, des oligolevans, et des produits de transfructosylation en général ont été étudiés à travers la méthode des surfaces de réponses. Les résultats expérimentaux ont confirmé et validé les prédictions des modèles développés. La même analyse a démontré que le niveau du sucrose est la variable la plus influante parmi les variables évaluées, tandis que le ratio de la levansucrase et de l'endo-inulinase a eu un impact important sur la synthèse de levanohexaose et des oligolevans. Étant donné que la température de la réaction biocatalytique et les concentrations des substrats sont faibles, ce nouveau système bi-enzymatique démontre un grand potentiel pour les applications au niveau industriel. Par ailleurs, le temps de la réaction plutôt bref et les rendements élevés des FOSs démontrent la supériorité du système bi-enzymatique développé en comparaison avec les systèmes biocatalytiques actuels qui ont été documentés.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.119466 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Tian, Feng |
| Contributors | Salwa Karboune (Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Doctor of Philosophy (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically-submitted theses. |
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