Whey proteins play a vital role in the manufacture of food products due to their nutritional value and versatile functional properties. α-Lactalbumin (α-LA) is the second most abundant protein in bovine whey and the most abundant protein of human whey. α-LA is a low-molecular-weight (14.2 kDa) and acidic (pI 4-5) protein that is produced in the lactating mammary glands and has a role in lactose biosynthesis. BAMLET/HAMLET (bovine/human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells) are complexes of α-LA and oleic acid that have been shown to have cytotoxic effects on tumor cells but not on healthy cells. In vitro, it has been reported that BAMLET-type complexes can be prepared by heating a solution of bovine apo (calcium-depleted) α-LA in sodium phosphate buffer to which an ethanol solution of oleic acid has been added. However, the possibility that the presence of ethanol may facilitate the complexation of oleic acid with α-LA by affecting the thermal denaturation of the protein has not been investigated In the present study, the combined effects of ethanol and temperature on the secondary structure of bovine apo α-LA were examined by variable-temperature Fourier transform infrared (VT-FTIR) spectroscopy in conjunction with Fourier self-deconvolution (a resolution enhancement technique) and two-dimensional cross correlation spectroscopy (2D CCS). At room temperature, an increase in α-helical and β-structure content at the expense of 310-helices and turns was observed as a function of increasing the concentration of ethanol (from ~2.5 to 33% w/v). These findings are consistent with the fluorescence and proteolysis studies of α-LA reported in the literature, which showed a similar effect of ethanol on the secondary structure of α-LA. Subjecting bovine apo α-LA solutions to a heating–cooling cycle (heating from 25 to 950C and cooling from 95 to 250C) in the presence of varying concentrations of ethanol was found to alter the protein's secondary structure. At any concentration of ethanol the α-helix and 310-helices of the secondary structure of bovine apo α-LA were lost upon heating of the protein. The sequences of the changes in secondary structure during the heating and cooling cycles were elucidated by 2D CCS. The results revealed that the protein refolded during the cooling cycle by reversal of the sequence of unfolding events during the heating cycle only in the presence of 20% or higher concentration of ethanol. Overall, the present study supported the ethanol-induced reversible thermal denaturation of bovine apo-α-LA. / Étant donné leur valeur nutritive et leurs multiples propriétés fonctionnelles, les protéines du lactosérum jouent un rôle crucial dans la fabrication de denrées alimentaires. L'α-lactalbumine (α-LA) est la plus abondante protéine parmi celles du lactosérum bovin et la seconde plus abondante protéine parmi celles du lactosérum humain. L'α-LA , une protéine acide (pI 4-5) à faible poids moléculaire (14.2 kDa) produite dans les glandes mammaires, joue un rôle important dans la biosynthèse du lactose. Composés des complexes d' α-LA et d'acide oléique, le BAMLET/HAMLET (bovine/human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells) a démontré des effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, tout en laissant les cellules saines indemnes. On rapporte que les complexes de type BAMLET peuvent être préparées en chauffant une solution d'apo (décalcifiée) α-LA bovine dans un tampon de phosphate de sodium à laquelle on ajoute une solution d'acide oléique dissoute dans de l'alcool éthylique. Cependant, la possibilité que la présence d'alcool éthylique facilite la complexation de l'acide oleique acid à l'α-LA en influençant la dénaturation thermique de la protéine n'a pas été évaluée. Dans la présente étude, les effets combinés de l'alcool éthylique et de la température sur la structure secondaire de l'apo α-LA bovine furent examinés par spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier opérant à température variable (VT-FTIR) en combinaison avec une autodéconvolution de Fourier (technique d'amélioration de la résolution) et de spectroscopie à corrélation croisée en deux dimensions (2D CCS). À la température de la pièce, une augmentation de la concentration en alcool éthylique d'environ 2.5% à 33% w/v donna lieu à une augmentation des structures en hélices alpha et à feuillets bêta, aux dépends d'hélices et coudes 310. Ces résultats sont conformes à ceux de plusieurs études fluoroscopiques et protéolytiques de l'α-LA préalables, montrant un effet semblable de l'alcool éthylique sur la structure secondaire de l'α-LA. Soumettant l'apo α-LA bovine à un cycle de chauffage-refroidissement entre des extrêmes de 25°C et 95°C, en présence de différentes concentrations d'alcool éthylique, s'avéra modifier la structure secondaire de la protéine. A toutes concentrations d'alcool éthylique, les hélices alpha et 310 de la structure secondaire de l'apo α-LA bovine furent perdues lorsque la protéine fut chauffée. La séquence des altérations de la structure secondaire durant les cycles de chauffage-refroidissement fut suivie par 2D CCS. Les résultats démontrèrent que ce fut seulement en la présence d'une concentration de 20% ou plus d'alcool éthylique que la protéine se replia durant le refroidissement, en suivant une séquence inverse à celle de son dépliement durant le réchauffement. Globalement, la présente étude confirma la dénaturation thermale réversible de l'apo-α-LA bovine comme étant induite par l'alcool éthylique.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LACETR/oai:collectionscanada.gc.ca:QMM.123309 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Singh, Amandeep |
| Contributors | Ashraf A Ismail (Internal/Supervisor) |
| Publisher | McGill University |
| Source Sets | Library and Archives Canada ETDs Repository / Centre d'archives des thèses électroniques de Bibliothèque et Archives Canada |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation |
| Format | application/pdf |
| Coverage | Master of Science (Department of Food Science and Agricultural Chemistry) |
| Rights | All items in eScholarship@McGill are protected by copyright with all rights reserved unless otherwise indicated. |
| Relation | Electronically submitted theses |
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