Fusarium é um grande gênero de fungos filamentosos amplamente distribuídos que são importantes patógenos de plantas, animais e humanos. As doenças causadas por Fusarium spp. geram grandes perdas econômicas na produção de frutas, legumes, cereais e de celulose. Em humanos, o controle da fusariose com apenas um antifúngico é ineficaz, apresentando uma elevada taxa de mortalidade, especialmente em pacientes imunocomprometidos. A maior resistência aos fungicidas utilizados atualmente tem estimulado o desenvolvimento de novas tecnologias mais eficazes para o controle de fungos patogênicos. Assim, é necessária a busca de alternativas para o controle de microrganismos em ambas as áreas, clínica e agrícola. A inativação fotodinâmica antimicrobiano (IFA) é uma promissora plataforma antifúngica alternativa que pode ser utilizada para controlar o inóculo de fungos em mamíferos e no meio ambiente. A IFA baseia-se na utilização de um fotossensibilizador (FS) que se acumula na célula fúngica alvo. A exposição do FS à luz com um comprimento de onda apropriado, inicia um processo fotoquímico que produz espécies reativas de oxigênio (EROs), principalmente o oxigênio singleto, causando um dano oxidativo não especifico levando a morte da célula fúngica, sem dano significativo às células do hospedeiro. Em comparação com os fungicidas utilizados atualmente, a multiplicidade dos danos causados pelas EROs, reduzem a chance de selecionar microrganismos tolerantes. No presente trabalho, avaliamos o efeito da IFA com a combinação de luz vermelhas com fluências de 10 e 15 J cm-2 e cinco FS fenotiazínicos, azul de metileno (MB), azul de toluidina O (TBO), novo azul de metileno N fórmula sem zinco (NMBN), novo azul de metileno N formula com zinco (NMBN Zn) e um novo fenotiazínico pentacíclico S137, em microconídios não germinados e 4 h-germinados de Fusarium oxysporum, F. moniliforme e F. solani. A IFA com NMBN Zn resultou em uma redução de aproximadamente 5-logs na sobrevivência dos microconídios não germinados (quiescentes) e 4 h-germinados (metabolicamente ativos) das três espécies de Fusarium quando expostas a luz na fluência de 15 J cm-2. A lavagem dos microconídios não germinados e 4 h-germinados para retirar o excesso de FS antes da exposição à luz reduziu, porém não impediu a morte provocada pela IFA. A IFA com todos os FS e fluência aumentou a permeabilidade da membrana celular dos microconídios nas três espécies de Fusarium. O dano oxidativo causado pelas EROs produzidos durante o processo fotoquímico da IFA foi avaliado nos lipídios, proteínas e DNA dos microconídios das espécies de Fusarium. Foi observado um aumento da peroxidação lipídica em microconídios das três espécies de Fusarium após a IFA com NMBN Zn e S137. Observamos o aumento na carbonilação de proteínas em microconídios de F. oxysporum após IFA subletal com todos os FS. O aumento no dano do DNA em microconídios não germinados e 4 h-germinados foi observado apenas para o S137 na fluência de 0, 10 e 15 J cm-2. Nossos estudos expandem a compreensão da inativação fotodinâmica de fungos filamentosos / Fusarium is a large genus of filamentous fungi widely distributed wich are important pathogens of plants, animals and humans. Crop diseases caused by Fusarium generate great economic losses in the production of fruit, vegetables, cereals, and cellulose. In humans the control of progression of fusariosis by single-agent antifungal therapy is problematic, leading to a high mortality rate, especially with immunocompromised patients. The increased tolerance to currently used fungicides has stimulated the development of novel and effective technologies to control pathogenic fungi. Thus, the search for alternatives to control microorganisms is necessary in both, clinical and agricultural areas. Antimicrobial photodynamic treatment (APDT) is a promising alternative antifungal platform that can be used to control fungi both in mammalian hosts and in the environment. APDT is based on the use of a photosensitizer (PS) that accumulates in the target fungal cell. The exposure of the PS to light of an appropriate wavelength starts a photochemical process that produces reactive oxygen species (ROS), especially singlet oxygen, leading to non-specific oxidative damage causing the death of the fungal cell without significant harm to the host cells. In comparison with currently used fungicides, the multiple and variable targets of ROS reduce the chance of selecting tolerant microorganisms. In the present study, we evaluated the effect of APDT with the combination of red light with fluence of 10 and 15 J cm-2, and five phenotiazinium photosensitizer, methylene blue (MB), toluidine blue O (TBO), new methylene blue N zinc free form (NMBN), new methylene blue N zinc chloride double salt (NMBN Zn) and a novel pentacyclic phenothiazinium S137, on ungerminated and germinated microconidia of Fusarium oxysporum, F. moniliforme and F. solani. APDT with NMBN Zn resulted in a reduction of approximately 5 logs in the survival of the quiescent ungerminated microconidia and metabolically active germinated microconidia of the three Fusarium species when the light fluence of 15 J cm-2 was applied. Washing out the PS from both ungerminated and germinated microconidia before light exposure reduced but did not prevent the killing effect of APDT. APDT with all the PS and fluences increased cell membrane permeability for the three Fusarium species. The oxidative damage caused by ROS produced during the photochemical process of APDT, was evaluated in the lipids, proteins and DNA present in the microconidia. Increases in lipid peroxidation in microconidia of the three Fusarium species were observed only after APDT with NMBN Zn and S137. Proteins oxidative damage was observed by the increase in protein carbonylation in microconidia of the F. oxysporum after APDT with all PS. The increases in DNA damage from both ungerminated and germinated microconidia was observed only for S137 at fluence of 0, 10 and 15 J cm-2. Our study expands the understanding of photodynamic inactivation in filamentous fungi
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03072017-073451 |
| Date | 16 March 2017 |
| Creators | Menezes, Henrique Dantas de |
| Contributors | Kress, Marcia Regina von Zeska |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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