The use of super-resolution (SR) microscopy is an important tool for understanding the inside mechanisms of bacterial cells. However, for SR imaging, the labelling of the proteins of interest is a great challenge as flourescent proteins (FPs) are often too big to be directly fused to the target protein and traditional immunolabelling with antibodies creates too long separation between the fluorophore and the target protein. In an attempt to overcome this hurdle, the Escherichia coli (E. coli) cell division protein FtsZ is in this project fused to a nanotag (NT) that is subsequently labelled with a nanobody (NB). The ALFA-tag, a short amino acid peptide, is chromosomally fused to the target protein, creating a MG1655/FtsZ-ALFA strain where all FtsZ proteins have an ALFA-tag attached. Recognising the ALFA-tag is the NB αALFA (anti-ALFA) which is fused to a FP and expressed from a plasmid. The MG1655/FtsZ-ALFA strain is labelled using standard plasmid transformation which allows for live cell imaging of the division ring in E. coli. Both FPs sfGFP and mEos3.2 are used for labelling which means that the cells can be imaged in epifluorescence microscopy and single-molecule Photo-Activated Localisation Microscopy (PALM), and even single-molecule time lapses of the constricting FtsZ-ring is possible. This system is also applicable to other bacterial proteins. / Superupplösningsmikroskopi (SUM) är ett viktigt redskap för att förstå de inre processerna i en bakteriecell. Att på ett framgångsrikt sätt tagga målproteinerna har dock visat sig vara en utmaning för SUM. Att direkttagga målproteinerna med fluorescerande protein är oftast inte möjligt på grund av de fluorescerande proteinernas storlek och traditionell märkning med antikroppar skapar ett för stort avstånd mellan fluorofor och målprotein. För att överkomma detta problem taggas här celldelningsproteinet FtsZ iEscherichia coli (E. coli) med hjälp av nanotaggar (NT) och nanokroppar (NK). ALFA-taggen, en kort aminosyrapeptid, är kromosomt bunden till FtsZ i cellinjen MG1655/FtsZ-ALFA, så att varje FtsZ protein som produceras har en ALFA-tag bunden till sig. NK αALFA (anti-ALFA) känner igen och binder till ALFA-taggen när de kommer i kontakt. NK är bunden till ett fluorescerande protein och uttryckt från en plasmid vilket gör att MG1655/FtsZ-ALFA kan bli taggad med hjälp av vanlig plasmidtransformation. Denna metod möjliggör mikroskopi av divisionsringen i levande E. coli-celler. Två olika fluorescerande protein används, sfGFP och mEos3.2, vilket innebär att både epifluorensmikroskopi och fotoaktiverad lokaliseringsmikroskopi (PALM) kan användas. Dessutom är även intervallfotografering i enmolekylmikroskopi av divisionsringens konstriktion möjligt. Denna märkningsteknik är vidare applicerbar på andra bakteriella protein.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kth-328390 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Westlund, Emma |
| Publisher | KTH, Tillämpad fysik |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | English |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | TRITA-SCI-GRU ; 2023:041 |
Page generated in 0.0024 seconds