Com o objetivo de demonstrar a existência de substâncias extracelulares em urediniosporos de Hemileia vastatrix , capazes de desencadear a formação de fitoalexinas, foram utilizados bioensaios com cotilédones de soja. Para tanto foi inicialmente selecionada, através de bioensaios, a variedade de soja IAC-8, entre as variedades IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 e Cristalina, por ser a mais adequada quanto à capacidade de sintetizar a fitoalexina gliceolina e quanto à uniformidade de resposta em presença de um elicitor ativo nestes tecidos, proveniente de extrato comercial de células autolisadas da levedura Saccharomyces ceresiviae Meyen. Foi possível verificar que substâncias presentes no filtrado de suspensão aquosa de urediniosporos autoclavados de H. Vastatrix são capazes de desencadear a síntese da fitoalexina gliceolina em cotilédones de soja, variedade IAC-8. Objetivando o isolamento da substância elicitora extracelular, mais ativa, proveniente de urediniosporos de H. vastatrix, o filtrado aquoso foi submetido à purificação através de precipitação etanólica fracionada, seguida de cromatografias em colunas de Concanavalina-A Sepharose 4B, DEAE-celulose e Bio-Gel P-60, sendo estas etapas intercaladas por diálise. Pôde-se verificar que a atividade elicitora relativa aumentou gradativamente durante o processo de purificação, sendo que a fração elicitora mais pura apresentou uma atividade relativa 16,7 vezes maior do que aquela detecta- da para o filtrado aquoso bruto. O elicitor extracelular mostrou-se ativo mesmo quando concentrações equivalentes a 0,92 µg de carboidratos foram aplicadas por cotilédone. A atividade elicitora aumentou quando foram utilizadas concentrações crescentes do elicitor, atingindo um máximo à concentrações equivalentes a 10 µg de carboidratos por cotilédone. Foi possível observar que o elicitor, extracelular de H. vastatrix, solúvel em água e termoestável, e precipitado com etanol a 80% (v/v), não apresenta afinidade pela lectina Concanavalina-A e nem tampouco pelo trocador aniônico dietilaminoetil-celulose e possui um peso molecular menor que 60.000 e maior que 6.000 daltons. Visando elucidar a natureza química do elicitor extracelular de H. vastatrix, frações ativas foram submetidas a testes químicos para quantificação de carboidratos e proteínas, análise por cromatografia em fase gasosa e a tratamentos com metaperiodato de sódio e com as enzimas pronase, α-manosidase, β-galactosidase e β-glucosidase. O elicitor extracelular é oxidado pelo metaperiodato de sódio, o que acarreta a perda de sua atividade elicitora (94,63%), sendo esta parcialmente recuperada (56,20%) por redução com borohidreto de sódio e posterior hidrólise ácida fraca. Entretanto, a atividade elicitora não é alterada pelos tratamentos com as referidas enzimas. Os resultados ,obtidos evidenciam que o elicitor extracelular de H. vastatrix possui natureza polissacarídica, apresentando como principal componente a manose (88,77%), seguida pela glucose (6,67%) e a galactose (4,56%), sendo que os monossacarídeos componentes das moléculas dos polissacarídeos estão unidos entre si por ligações do tipo β.O polissacarídeo extracelular isolado de urediniosporos de H. vastatrix possui uma atividade biológica inespecífica, pois é capaz de desencadear a formação de fitoalexinas em uma planta não-hospedeira a H. vastatrix como a soja. / In order to demonstrate the presence of extracellular substances from uredionospores of Hemileia vastatrix, able to elicit the accumulation of phytoalexins, bioassays on soybean cotyledons were employed. Firstof all, among the soybean cultivars IAC-7, IAC-8, IAC-11, IAC-12 and Cristalina, the IAC-8 cultivar was selected through the cotyledon bioassays for further experiments, since it exhibited a more suitable and uniform response to an active glyceollin elicitor, isolated from a commercially available extract of the yeast Saccharomyces cerevisiae Meyen. It was possible to verify that substances present in the filtrate of water-washes from autoclaved urediniospores of H. vastatrix were able to stimulate the synthesis of the phytoalexin glyceollin in IAC-8 soybean cotyledons. In order to isolate the extracellular elicitor from H. vastatrix, filtrates of water-washes of the autoclaved urediniospores, were purified through fractionated ethanolic precipitation, followed by column chromatography on Concanavalin-A Sepharose 4B, DEAE-cellulose and Bio-Gel P-60, intercalated with dialysis. It was possible to verify that the relative elicitor activity gradually increased throughout the purification steps and that the purest elicitor fraction showed a relative elicitor activity 16.7 times greater than that exhibited by the crude filtrate. The purified extracellular elicitor was active even when concentration equivalent to 0.92 μg of carbohydrate were applied per cotyledon. It was observed that the water-soluble extracellular elicitor from H. vastatrix was heat-stable, precipitated with 80% ethanol (v/v), had no affinity neither for the Concanavalin-A lectin nor for the anion exchanger diethyl aminoethyl-cellulose. The elicitor showed a molecular weight lower than 60,000 and greater than 6,000 daltons. In order to elucidate the chemical nature of the extracellular elícitor from H. vastatrix, active fractions were submitted to chemical tests, analysis through gas-liquid chromatography and treatments with sodium metaperiodate and a150 with pronase, α-mannosidase, β-galactosidase and β-glucosidase. The extracellular elicitor was sensitive to the sodium metaperiodate, that caused the elimination of its elicitor activity (94.63%). The biological activity was partially regained (56.20%) when the periodate-degraded polymers were reduced with sodium borohydride, followed by a mild acid hydrolysis. However, the elicitor activity was not affected by the mentioned enzyme treatments. Yet, the results showed that the extracellular elicitor from H. vastatrix was a β-linked polysaccharide that presented mannose the major component (88.77%), followed by glucose (6.67%) and galactose (4.56%). The extracellular polysaccharide isolated from urediniospores of H. vastatrix showed an unspecific biological activity, due to its ability to elicit phyto alexin accumulation on a non-host plant to H. vastatric as the soybean.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20181127-161346 |
| Date | 30 August 1989 |
| Creators | Guzzo, Sylvia Dias |
| Contributors | Moraes, Walkyria Bueno de Camargo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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